應(ying)用(yong)FRR葉(ye)綠素(su)熒光(guang)誘(you)導技(ji)術(shu)估(gu)算(suan)有效光反(fan)應(ying)中(zhong)心含量(liang)

      PSII可與(yu)PSI協(xie)同(tong)從水(shui)中(zhong)獲(huo)取(qu)電子生(sheng)成(cheng)還原(yuan)體(ti)、驅(qu)動(dong)光化學(xue)反(fan)應(ying)和植(zhi)物營(ying)養(yang)循(xun)環(huan)。因(yin)此(ci)有效PSII光反(fan)應(ying)中(zhong)心（[PSII]active）的含(han)量(liang)可作(zuo)為植(zhi)物生(sheng)產力評(ping)估(gu)的(de)基礎因子，同(tong)時也是評估(gu)植(zhi)物光(guang)合(he)速率(lv)、研(yan)究植(zhi)物脅迫響應(ying)的關鍵。而(er)對於(yu)液體(ti)樣品(pin)，[PSII]active含量(liang)同(tong)樣是(shi)評(ping)估(gu)水(shui)生(sheng)生(sheng)物光(guang)合(he)作用(yong)速率(lv)以(yi)及(ji)分析浮遊植(zhi)物對(dui)脅迫的響應(ying)的關鍵參(can)數(shu)。但傳(chuan)統上(shang)缺(que)少(shao)穩(wen)定(ding)、可靠(kao)、快(kuai)速的 [PSII]active含量(liang)的(de)測(ce)量方(fang)法。

      傳(chuan)統上(shang)對(dui)於(yu)[PSII]active的測(ce)量(liang)：

• 免(mian)疫(yi)印(yin)跡法測(ce)定(ding)PSII蛋(dan)白復合體(ti)的豐度：

        不能說明其中(zhong)能夠貢獻於(yu)持續(xu)電(dian)子傳(chuan)遞(di)的(de)、光化學(xue)有(you)效的PSII蛋(dan)白復合體(ti)的含量(liang)。

• 放(fang)氧(yang)法對(dui)[PSII]active含量(liang)值(zhi)進(jin)行測(ce)量(liang)：

        耗(hao)時長(chang)：每(mei)個樣(yang)品(pin)要(yao)測量(liang)大概15 min；不準(zhun)確(que)；需要(yao)濃縮(suo)懸(xuan)浮(fu)物樣(yang)品(pin)至(zhi)很(hen)高(gao)的(de)濃度，才能(neng)檢(jian)測到(dao)明顯(xian)的參(can)數(shu)變(bian)化。同(tong)時，在(zai)測量過(guo)程(cheng)中(zhong)，氧氣的(de)消耗(hao)及(ji)其多種代謝(xie)途徑會影響測(ce)量結(jie)果。因(yin)此(ci)不適合(he)測(ce)量培養(yang)物的(de)動(dong)態(tai)生(sheng)理(li)變(bian)化，更(geng)不適合(he)測(ce)量持續(xu)變(bian)化環(huan)境(jing)中(zhong)的自然(ran)種群。因(yin)而(er)無論(lun)對於(yu)實驗室研究還是(shi)野外(wai)實驗，很(hen)多情(qing)況(kuang)下都不適用(yong)。

      本文(wen)將(jiang)介(jie)紹加拿(na)大(da)蒙(meng)特(te)愛立森(sen)大(da)學的Campbell教授(shou)的研(yan)究------應(ying)用(yong)FRR葉(ye)綠素(su)熒光(guang)誘(you)導技(ji)術(shu)進(jin)行[PSII]active含量(liang)估(gu)算(suan)的方法。該(gai)方(fang)法有效解決了(le)傳(chuan)統測(ce)量方(fang)法存在(zai)的問(wen)題。其原(yuan)理(li)是(shi)：在(zai)壹定體(ti)積(ji)下：

a）F’_o強度與(yu)[PSII]active色素(su)含量(liang)相關(guan)；

b）σ’_PSII與(yu)PSII色(se)素(su)總含(han)量相(xiang)關。

        因此(ci)，F’_o/σ’_PSII可以(yi)代表(biao)單位(wei)體(ti)積(ji)的(de)[PSII]active含量(liang)。(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)。而(er)這兩(liang)個參(can)數(shu)都可以(yi)利(li)用(yong)快(kuai)速飽(bao)和及(ji)弛豫(yu)熒光(guang)誘(you)導程(cheng)序（fast repletion and relaxation (FRR) fluorescence induction）獲(huo)得(de)。（註：σ’_PSII: 光適應(ying)狀態(tai)下PSII的有效吸(xi)收(shou)截(jie)面(mian)；F’_o：光適(shi)應(ying)下的基礎熒光(guang)。）

        為了(le)證明該(gai)方(fang)法用(yong)於(yu)估(gu)算(suan)[PSII]active含量(liang)可靠(kao)、可行，即(ji)受(shou)非(fei)光化熒光(guang)淬(cui)滅影響(xiang)很(hen)小、測(ce)量(liang)快(kuai)速並(bing)且穩(wen)定(ding)、具(ju)有時間分辨性(xing)、可應(ying)用(yong)於(yu)對湖泊和海(hai)洋水(shui)體的初(chu)級(ji)生(sheng)產力的(de)快(kuai)速評估(gu)，該(gai)研(yan)究進(jin)行了(le)209次(ci)成(cheng)對測定，對(dui)不同(tong)培養(yang)和處(chu)理(li)條(tiao)件下的海(hai)洋藍(lan)藻(zao)、分別(bie)在(zai)高(gao)光(guang)和低(di)光處(chu)理(li)下的原(yuan)生(sheng)態(tai)型球(qiu)藻(zao)、北(bei)極和溫帶(dai)的(de)綠(lv)藻、兩(liang)種中(zhong)心矽(gui)藻(zao)進(jin)行測(ce)試(shi)。

        由於(yu)藻類(lei)的生(sheng)理(li)狀(zhuang)態(tai)對(dui)培養(yang)密(mi)度、光照(zhao)條(tiao)件、氣體(ti)狀(zhuang)態(tai)、溫(wen)度、pH值(zhi)等都很(hen)敏感(gan)，進(jin)而(er)直接(jie)影(ying)響所(suo)得(de)參(can)數(shu)和公(gong)式的科學(xue)性(xing)，所(suo)以需要(yao)精確(que)控制(zhi)培養(yang)條(tiao)件並(bing)實時監測培養(yang)狀(zhuang)態(tai)。因(yin)此(ci)本研(yan)究使用(yong)FMT150光養(yang)生(sheng)物反(fan)應(ying)器對中(zhong)心矽(gui)藻(zao)兩(liang)個藻(zao)株(zhu)分別(bie)在(zai)2種不同(tong)狀態(tai)下進(jin)行培養(yang)和監測，精(jing)確(que)控制(zhi)營(ying)養(yang)濃度、溫度、光照(zhao)，並(bing)自動(dong)進(jin)行恒(heng)化培養(yang)。在(zai)培養(yang)過(guo)程(cheng)中(zhong)儀(yi)器自動(dong)使用(yong)水(shui)蒸氣飽(bao)和的空(kong)氣氣泡混(hun)勻，避(bi)免(mian)沈降(jiang)。（FMT150光養(yang)生(sheng)物反(fan)應(ying)器介(jie)紹見後附(fu)）

        之後使用(yong)FL3500（當前升級為(wei)FL6000）測量(liang)每(mei)個樣(yang)品(pin)的(de)F’_o和σ’_PSII，用(yong)以計(ji)算(suan)[PSII]active。FL3500可自(zi)動控制(zhi)和測量(liang)樣(yang)品(pin)溫(wen)度、預施光(guang)照(zhao)、光化光(guang)、單(dan)周(zhou)轉(zhuan)飽(bao)和光閃(shan)、Q_A再(zai)氧(yang)化等8種默認(ren)測量(liang)程(cheng)序、精確(que)自定(ding)義(yi)程(cheng)序等。

        同(tong)時使用(yong)熒光(guang)光(guang)纖(xian)氧氣傳(chuan)感(gan)器測量(liang)密(mi)閉(bi)比(bi)色(se)皿(min)裏(li)樣(yang)品(pin)的(de)溶(rong)氧(yang)濃度。氧氣的(de)測(ce)量(liang)可由(you)儀(yi)器自帶(dai)軟件程(cheng)序自動(dong)控制(zhi)。

        放(fang)氧(yang)測量過(guo)程(cheng)如(ru)下圖所(suo)示(shi)：在(zai)FRR測量過(guo)程(cheng)中(zhong)，氧氣濃度隨(sui)激(ji)發光變(bian)化並(bing)與(yu)時間（橫(heng)軸）相(xiang)對應(ying)。將氧探頭(tou)固(gu)定(ding)在(zai)FL3500自動控溫(wen)探(tan)頭(tou)上(shang)，壹同(tong)插入(ru)FL3500測(ce)量(liang)單(dan)元(yuan)內的待測(ce)樣品(pin)中(zhong)。FL3500具(ju)有磁(ci)力攪(jiao)拌功能(neng)，該(gai)功能(neng)可由(you)觸控面(mian)板(ban)控制(zhi)，也可由(you)FL3500自帶軟件FluorWin程(cheng)序精確(que)定義(yi)。

         在(zai)初始300s的暗適(shi)應(ying)過(guo)程(cheng)中(zhong)記錄氧(yang)氣濃度作為(wei)暗(an)呼吸(xi)值(zhi)；之後用(yong)低(di)光（20 µmol.m^-2.s^-1）進(jin)行預(yu)光(guang)照(zhao)激(ji)活光(guang)系(xi)統並(bing)測量(liang)氧氣；在(zai)壹個FRR程(cheng)序結束後立刻測(ce)量氧氣濃度作為(wei)在(zai)FRR過(guo)程(cheng)中(zhong)的呼吸(xi)。二(er)者差值(zhi)用(yong)於(yu)估(gu)算(suan)樣品(pin)中(zhong)[PSII]active含量。

        之(zhi)後將樣(yang)品(pin)置(zhi)於(yu)光下300 s；再(zai)次(ci)進(jin)行FRR誘(you)導（見下圖）並(bing)測量(liang)氧濃度。再(zai)次(ci)估(gu)算(suan)樣品(pin)中(zhong)[PSII]active含量。公(gong)式為：

μmol PSII L-1=μmol O2s-1L-1×（25.025×10-3s Flash-1）×(4 Flash 1×1 PSII/O2)

        FRR測(ce)量(liang)過(guo)程(cheng)如(ru)下圖所(suo)示(shi)：先(xian)進(jin)行300 μs的(de)暗適(shi)應(ying)。預光照之(zhi)後使用(yong)40個（間隔(ge)2 μs）單周(zhou)轉(zhuan)光(guang)閃（1.2 μs， 65000 µmol.m^-2.s^-1）的(de)激(ji)發序列(lie)進(jin)行FRR誘(you)導，以逐漸關(guan)閉(bi)全部(bu)PSII；在(zai)這個過(guo)程(cheng)中(zhong)得(de)到F_o、F_M、σ_PSII、ρ（表(biao)示PSII 光反(fan)應(ying)中(zhong)心的連(lian)通性）。之後降低(di)光閃(shan)重(zhong)復速率(lv)，PSII逐漸打(da)開(kai)，此(ci)過(guo)程(cheng)持續(xu)0.25 s。黑(hei)暗2 s，PSII打(da)開(kai)。再(zai)施加第(di)二(er)次(ci)FRR誘(you)導，得(de)到F’_o2、F’_M2s、σ’_PSII2s……

        使用(yong)放(fang)氧(yang)法得(de)到的(de)[PSII]active對FRR得(de)到的(de) [PSII]active=F’_o/σ’_PSII 公(gong)式進(jin)行校(xiao)正(zheng)，得(de)到校(xiao)正參(can)數(shu)。

        本研(yan)究驗證了(le)前(qian)人(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)的假(jia)設(she)，應(ying)用(yong)FRR測量(liang)得(de)到的(de)[PSII]active矯正公(gong)式適用(yong)於(yu)本文(wen)所述(shu)所(suo)有藻(zao)類(lei)樣品(pin)，包括(kuo)：呈(cheng)指數(shu)增長(chang)的(de)樣(yang)品(pin)、短(duan)期生(sheng)理(li)波(bo)動的非(fei)穩(wen)態(tai)樣(yang)品(pin)、光(guang)抑制(zhi)樣品(pin)、低(di)濃度樣品(pin)、光(guang)適應(ying)下的樣品(pin)，並(bing)且受(shou)非(fei)光化熒光(guang)淬(cui)滅影響(xiang)很(hen)小。

         因此(ci)可以(yi)用(yong)FRR測量(liang)程(cheng)序來估(gu)算(suan)湖泊和海(hai)洋不斷變(bian)化的(de)環(huan)境中(zhong)的初級(ji)生(sheng)產力。

        本(ben)案(an)例文獻： Murphy C. D., Ni G., Li G., et al. (2016) Quantitating active photosystem II reaction center content from fluorescence induction transients. Limnol. Oceanogr. Methods. DOI:10.1002/lom3.10142

1. 本研究應(ying)用(yong)的FMT150藻(zao)類(lei)培養(yang)與(yu)在(zai)線(xian)監測系(xi)統(tong): 詳見北京易(yi)科泰生(sheng)態(tai)技(ji)術(shu)有(you)限公(gong)司(si)網(wang)站(zhan)

        FMT150 光氧(yang)生(sheng)物反(fan)應(ying)器為捷(jie)克PSI公(gong)司(si)生(sheng)產，北京易(yi)科泰生(sheng)態(tai)技(ji)術(shu)有(you)限公(gong)司(si)為(wei)PSI公(gong)司(si)在(zai)中(zhong)國(guo)的(de)*家代理(li)。FMT150容量分為400ml、1000ml、3000ml。另(ling)有(you)訂制大型版(ban)。

        FMT150將生(sheng)物反(fan)應(ying)器與(yu)監測儀(yi)器*地結合(he)在(zai)壹起，用(yong)於(yu)淡水(shui)、海(hai)水(shui)藻類(lei)和藍細菌(jun)（藍(lan)藻(zao)）等的(de)模(mo)塊化精(jing)確(que)光照(zhao)培養(yang)與(yu)生(sheng)理(li)監測。

ü 控制(zhi)單(dan)元(yuan)：包括(kuo)電(dian)腦與(yu)預(yu)裝(zhuang)軟件。用(yong)戶自(zi)定(ding)義(yi)程(cheng)序自動(dong)改(gai)變培養(yang)條(tiao)件並(bing)實時在(zai)線(xian)監測培養(yang)條(tiao)件與(yu)測(ce)量(liang)參(can)數(shu)。光(guang)強、光(guang)質(zhi)、溫(wen)度和通入(ru)氣體(ti)的(de)組(zu)分與(yu)流速都可以(yi)精確(que)調控。恒(heng)濁(zhuo)和恒化控制(zhi)模(mo)塊用(yong)於(yu)自動(dong)調控培養(yang)基(ji)的(de)pH值(zhi)和濁度。控制(zhi)單(dan)元(yuan)可同(tong)時控制(zhi)多臺FMT150進(jin)行同(tong)步實(shi)驗，保證不同(tong)處(chu)理(li)實(shi)驗間的(de)壹致性(xing)。

ü 監測單(dan)元(yuan)：包括(kuo)溶(rong)氧(yang)、CO₂、pH、培養(yang)光(guang)強(qiang)、溫(wen)度、OD 680、OD 720、以(yi)及(ji)葉(ye)綠素(su)熒光(guang)參(can)數(shu)Ft、Fo、Fm、Fm′和QY。

2. 本研究應(ying)用(yong)的氧(yang)氣實(shi)時測(ce)量解(jie)決方案(an)請(qing)咨(zi)詢(xun)北(bei)京易(yi)科泰生(sheng)態(tai)技(ji)術(shu)有(you)限公(gong)司(si)：

3. 本研究中(zhong)FRR（該(gai)功能(neng)須(xu)提前(qian)訂制）測量(liang)儀(yi)器：FL3500 （當前已升(sheng)級(ji)為FL6000）:

詳細見北京易(yi)科泰生(sheng)態(tai)技(ji)術(shu)有(you)限公(gong)司(si)易(yi)科泰網站(zhan)

        FL6000 雙(shuang)調制(zhi)葉(ye)綠素(su)熒光(guang)儀(yi)為(wei)捷克PSI公(gong)司(si)生(sheng)產，北京易(yi)科泰生(sheng)態(tai)技(ji)術(shu)有(you)限公(gong)司(si)為(wei)PSI公(gong)司(si)在(zai)中(zhong)國(guo)的(de)*家代理(li)。有(you)標(biao)準(zhun)版(ban)和快(kuai)速版。本研究應(ying)用(yong)的FRR測(ce)量程(cheng)序為快(kuai)速版提供。

        具(ju)備雙(shuang)通道(dao)測量控制(zhi)，壹個通道(dao)用(yong)於(yu)對藍(lan)綠藻(zao)或綠藻等微藻，葉(ye)綠體(ti)或類(lei)囊(nang)體懸(xuan)浮(fu)物、葉(ye)片碎(sui)片進(jin)行葉(ye)綠素(su)熒光(guang)測(ce)量；另(ling)壹個可選擇(ze)使用(yong)：測量(liang)和控制(zhi)樣(yang)品(pin)溫(wen)度或者氧氣。此(ci)外(wai)可選配(pei)遠紅(hong)光(guang)源（735 nm）、磁力攪(jiao)拌等功能(neng)。

        FL6000的測(ce)量單元(yuan)提(ti)供毫秒(miao)級(ji)低(di)強度測量(liang)光(guang)閃(shan)、超短單周(zhou)轉(zhuan)光(guang)、以及(ji)持續(xu)光(guang)化光(guang)，三者的強(qiang)度和持續(xu)時間全部(bu)可通過(guo)軟件實現(xian)非(fei)周(zhou)期(qi)的(de)精確(que)編(bian)程(cheng)控制(zhi)。檢(jian)測器為500 kHz/16位(wei) AD 轉(zhuan)換的PIN二(er)極管(guan)信(xin)號檢(jian)測器，測量(liang)葉(ye)綠素(su)熒光(guang)信(xin)號的(de)時間分辨率(lv)可高(gao)達(da)4 µs（快(kuai)速版為1µs）。AD轉換的增益(yi)和積分時間同(tong)樣可以(yi)通過(guo)軟件精確(que)控制(zhi)。

        內置(zhi)測量程(cheng)序如(ru)下：

        應(ying)用(yong)領域(yu)：光(guang)合自養(yang)生(sheng)物懸(xuan)浮(fu)物生(sheng)理(li)研(yan)究、PSII光化學(xue)效率(lv)測(ce)量、水(shui)體初級(ji)生(sheng)產力估(gu)算(suan)、浮遊植(zhi)物的(de)光(guang)合作(zuo)用(yong)和代謝(xie)擾動、藻(zao)華(hua)研究、藻類(lei)抗(kang)脅迫能力或者易(yi)感(gan)性(xing)研究、光合(he)系統工(gong)作機理(li)研(yan)究、受(shou)脅迫植(zhi)物光(guang)合(he)生(sheng)理(li)應(ying)對策略研究等。

        北京易(yi)科泰生(sheng)態(tai)技(ji)術(shu)有(you)限公(gong)司(si)是(shi)由(you)科學(xue)家創建並(bing)為科學(xue)家提供科技(ji)服務(wu)的新(xin)技(ji)術(shu)企(qi)業，是(shi)PSI公(gong)司(si)在(zai)中(zhong)國(guo)的(de)*家代理(li)和技(ji)術(shu)咨(zi)詢(xun)服務(wu)中(zhong)心。易(yi)科泰生(sheng)態(tai)技(ji)術(shu)公(gong)司(si)在(zai)青島(dao)、西(xi)安設(she)有(you)分公(gong)司(si)，在(zai)全國(guo)各(ge)地設(she)有(you)辦(ban)事(shi)處(chu)，北(bei)京總(zong)部(bu)設(she)立有(you) EcoLab 實(shi)驗室以提(ti)供實(shi)驗研(yan)究合作(zuo)、儀(yi)器技(ji)術(shu)培訓(xun)等。