FluorCam多(duo)光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)技術(shu)應(ying)用(yong)案(an)例(li)——植(zhi)物病害表(biao)型(xing)研(yan)究(jiu)

1. 植(zhi)物病害早期快速(su)無(wu)損檢測

由(you)於次(ci)生代謝(xie)產(chan)物如多(duo)酚等與植(zhi)物的(de)病害脅迫應(ying)答(da)機制(zhi)緊(jin)密相關。因此(ci)初，FluorCam多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)技術(shu)主要(yao)用(yong)於(yu)植(zhi)物病害早期快速(su)無(wu)損檢測，希望能在病害產(chan)生嚴(yan)重影(ying)響(xiang)前(qian)就能發現(xian)感(gan)染(ran)（圖4）。                 圖1. UV-MCF多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)早期(qi)研(yan)究(jiu)，左(zuo)：煙(yan)草(cao)花(hua)葉病毒感(gan)染(ran)的(de)多(duo)光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)連續觀測(ce)（Chaerle，2006）；右(you)：辣椒輕斑駁病毒感(gan)染(ran)早期(qi)的(de)多(duo)光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)分析（Pineda，2008）

隨著(zhe)研(yan)究(jiu)的(de)不(bu)斷深入(ru)，科學(xue)家們將多(duo)光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)與葉綠素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)、紅(hong)外熱成像(xiang)、以NDVI歸(gui)壹化(hua)植(zhi)被指(zhi)數(shu)為代表(biao)的(de)反(fan)射光(guang)譜(pu)成像(xiang)等其(qi)他(ta)表(biao)型(xing)分析技術(shu)結合(he)，開展了(le)更(geng)深入(ru)的(de)植(zhi)物病害檢測和(he)表(biao)型(xing)研(yan)究(jiu)工(gong)作(zuo)。

德國萊(lai)布(bu)尼茨(ci)蔬菜和(he)觀(guan)賞植(zhi)物研(yan)究(jiu)所IGZ致力(li)於通過(guo)這(zhe)些(xie)成像(xiang)分析技術(shu)發展壹(yi)種能夠(gou)高(gao)通量(liang)快速(su)檢(jian)測生物脅迫的(de)方(fang)法。他(ta)們使(shi)用(yong)了(le)壹種(zhong)模式植(zhi)物-病原(yuan)體(ti)系統生(sheng)菜(cai)-立枯絲(si)核菌(jun)（Rhizoctonia solani），希望通過(guo)這(zhe)幾(ji)種技術(shu)獲得的(de)數(shu)據能夠(gou)快速(su)將受(shou)到(dao)生物脅迫和(he)未受(shou)到(dao)脅迫的(de)植(zhi)株(zhu)區分開（Sandmann，2017）。

圖2. 生(sheng)菜-立(li)枯絲核(he)菌(jun)的(de)NDVI成像(xiang)圖與熱成像(xiang)圖

由(you)於這(zhe)幾(ji)種技術(shu)的(de)原(yuan)理不(bu)盡相(xiang)同，類似的(de)研(yan)究(jiu)中(zhong)經(jing)常需要(yao)使(shi)用(yong)多(duo)種(zhong)儀(yi)器才(cai)能完成。而(er)FluorCam多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)系統是目(mu)前*有(you)能力(li)實(shi)現(xian)了(le)壹臺儀(yi)器上同(tong)時完成葉綠素(su)熒(ying)光(guang)、多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)、NDVI歸(gui)壹化(hua)植(zhi)被指(zhi)數(shu)以及GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等(deng)熒(ying)光(guang)蛋白與熒(ying)光(guang)染(ran)料(liao)的(de)成像(xiang)分析功(gong)能，加(jia)裝(zhuang)熱成像(xiang)模塊後還(hai)可(ke)以進(jin)行(xing)熱成像(xiang)分析。這(zhe)些(xie)功能使(shi)得FluorCam多(duo)光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)系統就(jiu)成為了(le)壹套(tao)功能非(fei)常全面(mian)的(de)植(zhi)物病害表(biao)型(xing)研(yan)究(jiu)系統。

通過(guo)數據分析終發現(xian)葉綠素(su)熒(ying)光(guang)參數(shu)：PSII大量子(zi)產(chan)額Fv/Fm和(he)熒(ying)光(guang)衰(shuai)減(jian)比率Rfd的(de)區分效果(guo)好，誤(wu)差(cha)≤0.052。研(yan)究(jiu)者(zhe)希望通過(guo)進(jin)壹步(bu)工作(zuo)，將這(zhe)壹(yi)發現(xian)應(ying)用(yong)於(yu)園(yuan)藝(yi)和(he)農業生(sheng)產(chan)實(shi)踐。

圖3. FluorCam多(duo)光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)系統測(ce)量(liang)的(de)各(ge)項表(biao)型(xing)參數(shu)及(ji)分析數(shu)據結(jie)果

2. 葉片病害

細(xi)菌性(xing)軟(ruan)腐病菌Dickeya dadantii是農業上(shang)的(de)重(zhong)要病害。這(zhe)種(zhong)病菌會(hui)先(xian)圍繞壹(yi)個萎(wei)黃環(huan)出(chu)現(xian)多(duo)個壞死斑點，進(jin)而(er)整(zheng)個感(gan)染(ran)區域(yu)壞死並(bing)逐漸(jian)擴展到(dao)周圍的(de)組織(zhi)中(zhong)。FluorCam葉綠素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)、FluorCam多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)、熱成像(xiang)可(ke)以在時間和(he)空(kong)間尺度上分別(bie)反映細(xi)菌感(gan)染(ran)對光(guang)合(he)作(zuo)用(yong)、初(chu)級和(he)次(ci)級代謝(xie)和(he)氣(qi)孔(kong)活性(xing)的(de)影(ying)響。西班牙(ya)國家(jia)研(yan)究(jiu)委員會（CSIC）使(shi)用(yong)這(zhe)三種技術(shu)對甜(tian)瓜葉感(gan)染(ran)Dickeya dadantii進(jin)行(xing)了(le)成像(xiang)測量(liang)，同時通過(guo)機器(qi)學(xue)習來(lai)處(chu)理(li)這(zhe)些(xie)成像(xiang)技術(shu)獲得的(de)數(shu)據，建(jian)立數學算法來(lai)分類葉片感(gan)染(ran)區域(yu)（Pineda, 2018）。

圖4. 甜(tian)瓜葉感(gan)染(ran)Dickeya dadantii不同(tong)時期(qi)的(de)葉綠素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)、多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)和(he)熱成像(xiang)圖

根(gen)據成像(xiang)圖獲得的(de)葉綠素(su)熒(ying)光(guang)和(he)多(duo)光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)定(ding)量數(shu)據

除(chu)病毒和(he)細(xi)菌外(wai)，真菌(jun)引(yin)起的(de)植(zhi)物葉片病害也有(you)廣(guang)泛的(de)研(yan)究(jiu)，比如由(you)真菌(jun)Podosphaera fusc感(gan)染(ran)引(yin)起的(de)白粉(fen)病。通過(guo)對感(gan)染(ran)白粉(fen)病的(de)西(xi)葫蘆(lu)葉片進(jin)行(xing)FluorCam多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)和(he)熱成像(xiang)分析，發現(xian)多(duo)光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)參數(shu)F520/F680對於識別(bie)白粉(fen)病特(te)別(bie)靈(ling)敏(min)。這(zhe)也(ye)證(zheng)明(ming)了(le)多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)非(fei)常適(shi)用(yong)於(yu)類(lei)似(si)的(de)植(zhi)物表(biao)型(xing)研(yan)究(jiu)（Pineda, 2017）。

圖5. 感(gan)染(ran)白粉(fen)病的(de)西(xi)葫蘆(lu)葉片：（a）RGB成像(xiang)；（b）熱成像(xiang)；（c）多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)F440成像(xiang)；（d）多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)F520/F680成像(xiang)

3. 根(gen)系病害

由(you)於根(gen)系難(nan)以直接(jie)觀(guan)察和(he)檢(jian)測，因此(ci)根(gen)系病害具有(you)壹定(ding)的(de)隱(yin)蔽性。往(wang)往(wang)在發現(xian)病害時，其(qi)癥(zheng)狀已(yi)經(jing)發展到(dao)中後期。鱷梨根(gen)系感(gan)染(ran)白紋羽病Rosellinia necatrix後，通過(guo)葉片的(de)葉綠素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)、多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)、熱成像(xiang)分析，發現(xian)病害造成的(de)根(gen)系功能損失，能夠(gou)同步(bu)影響(xiang)葉片的(de)光(guang)合(he)生理(li)、次(ci)生代謝(xie)和(he)氣(qi)孔(kong)功能。而(er)葉綠素(su)熒(ying)光(guang)參數(shu)甚至可(ke)以在癥狀發展前(qian)就指(zhi)示(shi)出(chu)病害的(de)發生(sheng)。通過(guo)FluorCam多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)技術(shu)進(jin)行(xing)的(de)這(zhe)壹(yi)研(yan)究(jiu)既(ji)發現(xian)了(le)根(gen)系病害對植(zhi)物整(zheng)體(ti)生理(li)功能和(he)地上(shang)部(bu)表(biao)型(xing)的(de)影(ying)響，也為(wei)根(gen)系病害提供了(le)早期(qi)檢測工具（Granum, 2015）。

圖6. 感(gan)染(ran)白紋羽病的(de)鱷(e)梨：左：地上(shang)部(bu)RGB圖；右(you)：葉綠素(su)熒(ying)光(guang)、多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)與熱成像(xiang)圖

4. 種子(zi)病害

間座殼(ke)屬Diaporthe/擬莖(jing)點黴屬Phomopsis病原(yuan)菌復(fu)合(he)體(ti)是壹(yi)類大豆種(zhong)傳性(xing)病原(yuan)體(ti)。它會(hui)首先(xian)感(gan)染(ran)大豆種(zhong)子(zi)並(bing)以休(xiu)眠(mian)菌絲(si)的(de)形態(tai)存活(huo)。而(er)隨著(zhe)大(da)豆的(de)萌(meng)發和(he)生(sheng)長(chang)，它(ta)就會造成大豆種(zhong)腐病等嚴(yan)重病害。

阿根(gen)廷(ting)布宜(yi)諾斯艾利(li)斯大學(xue)嘗(chang)試(shi)使(shi)用(yong)不(bu)同(tong)的(de)非(fei)熱等(deng)離子(zi)體(ti)Non-thermal plasma處(chu)理(li)間座殼(ke)屬Diaporthe/擬莖(jing)點黴屬Phomopsis病原(yuan)菌復(fu)合(he)體(ti)侵染(ran)的(de)大豆種(zhong)子(zi)，然後對種子(zi)萌(meng)發和(he)營養生(sheng)長(chang)狀況進(jin)行(xing)評估(gu)，從(cong)而(er)確定(ding)這(zhe)種(zhong)種子(zi)病害消(xiao)毒方(fang)法是否(fou)理(li)想——既(ji)能控(kong)制病害，又不會對大豆的(de)營養生(sheng)長(chang)造(zao)成不利(li)影響。FluorCam葉綠素(su)熒(ying)光(guang)、FluorCam多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)、熱成像(xiang)等都(dou)為這(zhe)壹(yi)研(yan)究(jiu)提(ti)供(gong)的(de)重(zhong)要的(de)數(shu)據。實(shi)驗結果發現(xian)，非(fei)熱等(deng)離子(zi)體(ti)處(chu)理(li)後的(de)感(gan)染(ran)大豆，其(qi)光(guang)合(he)能力(li)與健康(kang)植(zhi)株(zhu)基本相(xiang)同(tong)。而(er)比起(qi)未進(jin)行(xing)處(chu)理(li)的(de)大(da)豆，其(qi)生(sheng)長(chang)狀況甚至(zhi)有(you)所提高(gao)（Pérez-Pizá, 2019）。

圖7. 左(zuo)：不同(tong)感(gan)染(ran)狀況和(he)處(chu)理(li)後的(de)大(da)豆幼(you)苗；右：大(da)豆的(de)RGB成像(xiang)、熱成像(xiang)、多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)成像(xiang)

參考文(wen)獻：

1. Chaerle L, et al. 2006, Multi-color fluorescence imaging for early detection of the hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus, Journal of Plant Physiology, doi:10.1016/j.jplph.2006.01.011

2. Pineda M, et al. 2008, Multicolor Fluorescence Imaging of Leaves—A Useful Tool for Visualizing Systemic Viral Infections in Plants, Photochemistry and Photobiology, 84: 1048-1060

3. Sandmann M, et al. 2017. The use of features from fluorescence, thermography and NDVI imaging to detect biotic stress in lettuce. Plant Disease, doi: 10.1094/PDIS-10-17-1536-RE

4. Pineda M, et al. 2018. Detection of bacterial infection in melon plants by classification methods based on imaging data. Front. Plant Sci. 9(164), doi: 10.3389/fpls.2018.00164

5. Pérez-Pizá MC, et al. 2019. Improvement of growth and yield of soybean plants through the application of non-thermal plasmas to seeds with different health status. Heliyon 5: e01495

6. Granum E, et al. 2015. Metabolic responses of avocado plants to stress induced by Rosellinia necatrix analysed by fluorescence and thermal imaging. Eur J Plant Pathol, DOI 10.1007/s10658-015-0640-9

7. Pineda M, et al. 2017. Use of multicolour fluorescence imaging for diagnosis of bacterial and fungal infection on zucchini by implementing machine learning. Functional Plant Biology

北(bei)京(jing)易(yi)科泰生(sheng)態(tai)技術(shu)公司(si)提(ti)供(gong)植(zhi)物病害表(biao)型(xing)研(yan)究(jiu)全面(mian)技術(shu)方(fang)案：

lFluorPen、FluorCam葉綠素(su)熒(ying)光(guang)/多光(guang)譜(pu)熒(ying)光(guang)技術(shu)

lSL3500、FytoScope智能LED光(guang)源與生長(chang)箱

lSpectraPen/PolyPen、Specim高(gao)光(guang)譜(pu)測(ce)量(liang)技術(shu)

lThermo-RGB紅(hong)外熱成像(xiang)技術(shu)

lPlantScreen植(zhi)物高(gao)通量(liang)表(biao)型(xing)成像(xiang)分析平臺

lEcoDrone無人(ren)機遙(yao)感(gan)技術(shu)方(fang)案