植(zhi)物(wu)熒(ying)光(guang)活體成像(xiang)技(ji)術及其(qi)應(ying)用

植物(wu)活(huo)體成像(xiang)技(ji)術能夠(gou)在(zai)不(bu)破(po)壞(huai)植(zhi)物組織的(de)前(qian)提(ti)下(xia)，利用壹套非常靈(ling)敏(min)的(de)光(guang)學檢測儀器(qi)，直(zhi)接(jie)監控活體(ti)植(zhi)物(wu)的細(xi)胞活(huo)動、光(guang)合(he)作用和基因行(xing)為(wei)。其(qi)中(zhong)應(ying)用*泛的(de)熒光(guang)活體成像(xiang)技(ji)術，由(you)於操作簡(jian)單(dan)、結果(guo)直(zhi)觀、靈(ling)敏(min)度(du)高等特(te)點(dian)，在(zai)植(zhi)物光(guang)合(he)機(ji)理(li)、突(tu)變體篩(shai)選(xuan)、抗逆基因與(yu)表(biao)型(xing)、生(sheng)理(li)節(jie)律與(yu)發育等研(yan)究(jiu)中都(dou)有(you)大(da)量的應(ying)用。

熒光(guang)活體成像(xiang)技(ji)術又(you)可以(yi)分(fen)為(wei)兩(liang)大(da)類(lei)：

壹是穩態熒光(guang)成像(xiang)，主(zhu)要(yao)針(zhen)對(dui)GFP等熒光(guang)蛋白(bai)和DAPI等熒光(guang)染料(liao)

二是(shi)瞬(shun)態熒光(guang)成像(xiang)，代(dai)表(biao)技(ji)術為(wei)脈(mai)沖(chong)調制(zhi)式（Pulse Amplitude Modulated，PAM）葉綠(lv)素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)技(ji)術，主要(yao)用於(yu)葉(ye)綠(lv)素(su)熒(ying)光(guang)動力學曲線(xian)的(de)成像(xiang)測(ce)量，反映植物光(guang)合(he)能力、光(guang)系統狀(zhuang)態、電子(zi)傳遞(di)鏈(lian)運(yun)行(xing)狀(zhuang)況等。

需(xu)要註(zhu)意的(de)是，壹般的(de)穩態熒光(guang)成像(xiang)技(ji)術也可(ke)以(yi)測(ce)量葉綠素(su)熒(ying)光(guang)，但(dan)只(zhi)能測量穩定狀(zhuang)態下的葉(ye)綠(lv)素(su)熒(ying)光(guang)。而(er)葉綠(lv)素(su)熒(ying)光(guang)的動態變化是(shi)與(yu)光(guang)合(he)電子(zi)傳遞(di)狀(zhuang)態密(mi)切(qie)相關的，只(zhi)有(you)脈(mai)沖(chong)調制(zhi)式葉(ye)綠素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)技(ji)術才(cai)能進行(xing)葉(ye)綠(lv)素(su)熒(ying)光(guang)動力學曲線(xian)測(ce)量，進而(er)獲取(qu)大(da)量與(yu)植(zhi)物(wu)光(guang)合(he)機(ji)理(li)相關的參(can)數(shu)與(yu)成像(xiang)圖(tu)。目(mu)前國際上僅(jin)有(you)FluorCam熒光(guang)成像(xiang)技(ji)術將(jiang)穩態熒光(guang)成像(xiang)技(ji)術與(yu)脈(mai)沖(chong)調制(zhi)式葉(ye)綠素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)技(ji)術融於壹體，是(shi)真正(zheng)功(gong)能全(quan)面的植物(wu)熒(ying)光(guang)活體成像(xiang)技(ji)術，能夠(gou)在(zai)壹臺儀器(qi)上實現(xian)GFP、BFP、CFP、YFP、RFP等熒光(guang)蛋白(bai)成像(xiang)、DAPI等熒光(guang)染料(liao)成像(xiang)、脈(mai)沖(chong)調制(zhi)式葉(ye)綠素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)以(yi)及(ji)NDVI反射光(guang)譜成像(xiang)分(fen)析(xi)功能。同時(shi)，除(chu)了(le)植(zhi)物樣(yang)品外(wai)，FluorCam熒光(guang)成像(xiang)技(ji)術也可(ke)以(yi)進行(xing)藻類、珊(shan)瑚(hu)共生(sheng)體、菌落乃至動(dong)物(wu)的(de)熒光(guang)成像(xiang)分(fen)析(xi)。

文獻(xian)案(an)例壹：抗病毒基因研(yan)究(jiu)

法國國家(jia)農(nong)業科(ke)學(xue)研(yan)究(jiu)院(yuan)（INRA）的Jean-Luc Gallois研(yan)究(jiu)團隊(dui)壹直(zhi)致(zhi)力於馬鈴薯(shu)y病毒(du)組的抗病基因研(yan)究(jiu)。這壹病毒(du)組中包(bao)括(kuo)蕪(wu)菁花(hua)葉病毒(du)(TuMV)、西(xi)瓜(gua)花葉病毒(du)(WMV)、三葉(ye)草(cao)黃脈(mai)病毒(du)(ClYVV)等重要的(de)農(nong)作物(wu)病(bing)毒。這(zhe)方面研(yan)究(jiu)的難(nan)點(dian)在(zai)於(yu)如何直(zhi)觀、定量地測(ce)量病毒在(zai)植(zhi)物樣(yang)品上的(de)分(fen)布(bu)與(yu)積(ji)累。FluorCam熒光(guang)成像(xiang)技(ji)術的出現(xian)解(jie)決(jue)了這(zhe)壹難(nan)題。法(fa)國國家(jia)農(nong)業科(ke)學(xue)研(yan)究(jiu)院(yuan)利用FluorCam封(feng)閉(bi)式(shi)熒(ying)光(guang)成像(xiang)系(xi)統，從(cong)2015年起發表了壹系列(lie)相關文章，研(yan)究(jiu)方向(xiang)包(bao)括(kuo)病(bing)毒的TOR信(xin)號調控、跨(kua)物(wu)種(zhong)合(he)成eIF4E1等位基因獲(huo)得(de)病毒抗性(xing)、利用CRISPR-Cas9 base editing基因編(bian)輯(ji)技(ji)術模仿eIF4E自(zi)然(ran)多態性(xing)與(yu)病(bing)毒(du)抗性(xing)的關系、擬(ni)南芥敲除eIF4E1獲得(de)ClYVV抗性(xing)但(dan)又(you)與(yu)TuMV的敏(min)感(gan)性(xing)相關等。這些(xie)研(yan)究(jiu)中，FluorCam熒光(guang)成像(xiang)技(ji)術提(ti)供(gong)了(le)關鍵(jian)的(de)GFP活體(ti)成像(xiang)圖(tu)，定量分(fen)析(xi)感染(ran)面積與(yu)病(bing)毒(du)積(ji)累量，從(cong)而(er)直(zhi)觀地反(fan)映(ying)了(le)不同基因功(gong)能對擬南芥病毒抗性(xing)的影(ying)響。同(tong)時(shi)，葉(ye)綠(lv)素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)則(ze)反(fan)映(ying)病(bing)毒對光(guang)合(he)系統的損(sun)傷(shang)，可以(yi)同步提(ti)供(gong)植(zhi)物(wu)的(de)光(guang)合(he)表型(xing)信(xin)息(xi)。

美國田納西(xi)大(da)學(xue)、突(tu)尼斯(si)El Manar大(da)學(xue)、法(fa)國艾(ai)克斯-馬賽(sai)大(da)學(xue)等科(ke)研(yan)機(ji)構也同樣(yang)使(shi)用FluorCam熒光(guang)成像(xiang)技(ji)術的RFP、GFP活體(ti)成像(xiang)功(gong)能進行(xing)了(le)TuMV、黃單(dan)孢(bao)菌屬等致(zhi)病(bing)菌的調控機(ji)理(li)研(yan)究(jiu)。                

參(can)考文獻(xian)：

1. Zafirov D, et al. 2021. When a knockout is an Achilles' heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Pathol. 22: 334–347
2. Bastet A, et al. 2019. Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR‐Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses. Plant Biotechnology Journal 17: 1736–1750
3. Bastet A, et al. 2018. Trans-species synthetic gene design allows resistance pyramiding and broad-spectrum engineering of virus resistance in plants. Plant Biotechnology Journal: 1–13
4. Ouibrahim L, et al. 2015. Potyviruses differ in their requirement for TOR signaling. Journal of General Virology 96, 2898-2903
5. Liu W. et al. 2014. Synthetic TAL effectors for targeted enhancement of transgene expression in plants. Plant Biotechnology Journal 12, 436–446
6. Abdelkefi H, et al. 2018. Guanosine tetraphosphate modulates salicylic acid signalling and the resistance of Arabidopsis thaliana to Turnip mosaic virus. Molecular Plant Pathology 19(3): 634-646

文獻(xian)案(an)例二(er)：珊(shan)瑚(hu)共生(sheng)體的生(sheng)態功能研(yan)究(jiu)

珊(shan)瑚(hu)是腔腸(chang)動(dong)物(wu)珊(shan)瑚(hu)蟲與(yu)蟲(chong)黃(huang)藻組成的共生(sheng)體。葡萄牙(ya)阿威(wei)羅大(da)學(xue)與(yu)美(mei)國喬治(zhi)亞(ya)大(da)學(xue)合(he)作研(yan)究(jiu)珊(shan)瑚(hu)共生(sheng)體的葉綠(lv)素(su)熒(ying)光(guang)成像(xiang)——反(fan)映(ying)光(guang)合(he)能力，NDVI反射光(guang)譜指(zhi)數(shu)成像(xiang)——反(fan)映(ying)葉(ye)綠(lv)素(su)的(de)分(fen)布(bu)及(ji)濃度變化，GFPs（綠色熒光(guang)蛋白(bai)類似(si)蛋白(bai)）成像(xiang)——珊(shan)瑚(hu)蟲本身(shen)具備(bei)的蛋(dan)白(bai)，但(dan)其(qi)意(yi)義(yi)尚不明確。目(mu)前只(zhi)有(you)FluorCam熒光(guang)成像(xiang)技(ji)術可以(yi)同(tong)步進行(xing)這(zhe)三種(zhong)成像(xiang)分(fen)析(xi)。研(yan)究(jiu)結果(guo)不但(dan)再(zai)次(ci)證實了(le)珊(shan)瑚(hu)本身(shen)具備(bei)*的光(guang)合(he)作用能力，而(er)且發現葉綠素(su)和GFPs的分(fen)布(bu)會隨(sui)著(zhe)珊(shan)瑚(hu)蟲的膨(peng)脹收縮(suo)而(er)同步變化，同(tong)時(shi)兩(liang)者間(jian)表(biao)現(xian)出顯(xian)著的分(fen)布(bu)差(cha)異。葉綠素(su)濃(nong)度(du)（NDVI）在(zai)珊(shan)瑚(hu)口盤處(chu)減(jian)少(shao)，而(er)GFPs則增(zeng)加。而(er)葉綠(lv)素(su)熒(ying)光(guang)參(can)數(shu)最大(da)光(guang)化學(xue)效率(lv)Fv/Fm的分(fen)布(bu)則(ze)沒(mei)有(you)與(yu)葉(ye)綠(lv)素(su)濃(nong)度(du)和GFPs的分(fen)布(bu)表(biao)現出相關性(xing)。

參(can)考文獻(xian)：

Leal MC, et al. 2015. Concurrent imaging of chlorophyll fluorescence, Chlorophyll a content and green fluorescent proteins-like proteins of symbiotic cnidarians. Marine Ecology, DOI: 10.1111/maec.12164

文獻(xian)案(an)例三：植(zhi)物(wu)內(nei)生(sheng)細菌開發

很(hen)多植(zhi)物內(nei)生(sheng)細菌（plant growth-promoting endophytic bacteria，PGPEB）對植(zhi)物(wu)的生(sheng)長都具有(you)促(cu)進作用，但(dan)如何有(you)效(xiao)利用內(nei)生(sheng)細菌，乃至將(jiang)其(qi)開(kai)發成壹種(zhong)新(xin)型(xing)肥料(liao)，就必(bi)須探(tan)索出壹整套(tao)制(zhi)劑配(pei)方策略(lve)。哥倫(lun)比亞(ya)農(nong)業研(yan)究(jiu)公司(si)與(yu)德國比(bi)勒菲(fei)爾德應(ying)用科(ke)學(xue)大(da)學(xue)、萊布(bu)尼茨(ci)蔬(shu)菜(cai)和觀賞(shang)作物(wu)研(yan)究(jiu)所（IGZ）合(he)作，開(kai)發壹種(zhong)植(zhi)物生(sheng)長促(cu)進內(nei)生(sheng)細菌Kosakonia radicincitans DSM16656的制(zhi)劑配(pei)方策略(lve)。這(zhe)種(zhong)內(nei)生(sheng)細菌可以(yi)通(tong)過蘿蔔(bu)根系(xi)形成內(nei)生(sheng)後，會顯著(zhu)促(cu)進蘿蔔(bu)的生(sheng)長。為(wei)了(le)能夠(gou)直(zhi)觀檢(jian)測(ce)不(bu)同配(pei)方處(chu)理(li)後細菌在(zai)蘿(luo)蔔(bu)根系(xi)的(de)活(huo)力，研(yan)究(jiu)者直(zhi)接(jie)將(jiang)不同(tong)處理(li)後帶GFP標(biao)記(ji)的(de)細菌液滴(di)與(yu)蘿(luo)蔔(bu)根系(xi)放(fang)置(zhi)到FluorCam開放(fang)式(shi)熒光(guang)成像(xiang)系(xi)統中，進行(xing)GFP成像(xiang)成像(xiang)分(fen)析(xi)。從(cong)GFP熒光(guang)強(qiang)度(du)上即可(ke)直(zhi)接(jie)反映(ying)不同處理(li)後內(nei)生(sheng)細菌的活(huo)性(xing)，從(cong)而(er)優化最(zui)佳的制(zhi)劑配(pei)方策略(lve)。

參(can)考文獻(xian)：

Barrera MC, et al. 2020. Formulating bacterial endophyte: Pre-conditioning of cells and the encapsulation in amidated pectin beads. Biotechnology Reports 26: e0046

北京(jing)易科(ke)泰(tai)生(sheng)態技(ji)術公司(si)提(ti)供(gong)植(zhi)物(wu)活(huo)體成像(xiang)研(yan)究(jiu)全(quan)面技(ji)術方案(an)：

• FluorCam葉綠(lv)素(su)熒(ying)光(guang)及熒光(guang)蛋白(bai)活體(ti)成像(xiang)系(xi)統
• FluorCam多光(guang)譜熒光(guang)成像(xiang)系(xi)統
• Thermo-RGB紅外(wai)熱成像(xiang)技(ji)術
• Specim高光(guang)譜成像(xiang)測(ce)量技(ji)術
• PhenoPlot輕便型(xing)作物(wu)植(zhi)物表(biao)型(xing)成像(xiang)分(fen)析(xi)系統
• PhenoTron®-HF植物(wu)表(biao)型(xing)與(yu)種(zhong)質(zhi)成像(xiang)分(fen)析(xi)平臺
• PlantScreen植物(wu)高(gao)通(tong)量表型(xing)成像(xiang)分(fen)析(xi)平臺