斑馬(ma)魚(yu)呼(hu)吸代謝及(ji)行為(wei)分(fen)析(xi)技(ji)術(shu)在生(sheng)態(tai)毒(du)理(li)學(xue)領域的應用(yong)

作為(wei)國(guo)際上廣受歡(huan)迎的模式(shi)動物(wu)，斑馬(ma)魚(yu)除(chu)了易(yi)於(yu)養殖(zhi)、性(xing)成(cheng)熟周期(qi)短(duan)、產卵(luan)量大等(deng)特點(dian)之外(wai)，還具有(you)受精(jing)卵(luan)體(ti)外(wai)發育、胚(pei)胎(tai)透(tou)明、易(yi)進行化(hua)合物(wu)的高(gao)通(tong)量篩(shai)選等(deng)諸多(duo)*的(de)優勢(shi)，並且(qie)人類和(he)斑馬(ma)魚(yu)之間生(sheng)理(li)和(he)遺(yi)傳上均有(you)高(gao)度同源性(xing)。

此(ci)外(wai)，傳統應(ying)用嚙齒類動物(wu)的毒(du)性(xing)測(ce)試受到越來越(yue)嚴(yan)苛(ke)的實驗(yan)動物(wu)福利(li)倫理(li)規(gui)定(ding)的(de)挑(tiao)戰(zhan)，而(er)應用(yong)培(pei)養細(xi)胞的體(ti)外(wai)測(ce)試方(fang)法由於(yu)缺(que)少生物(wu)體(ti)的復雜性(xing)限制了其(qi)實(shi)驗(yan)數據的(de)意(yi)義(yi)。因(yin)此(ci)斑馬(ma)魚(yu)為(wei)實(shi)驗(yan)動物(wu)的研究(jiu)近年(nian)來(lai)越來(lai)越(yue)受到毒(du)理(li)學(xue)領域科研工(gong)作者(zhe)的重視(shi)。不僅(jin)在探(tan)究(jiu)汙(wu)染(ran)物(wu)對(dui)水生生物(wu)的毒(du)性(xing)效應及(ji)其(qi)作用(yong)機(ji)制中(zhong)發揮了重要作用(yong)，相(xiang)關的數據還有(you)助於(yu)評價(jia)汙(wu)染(ran)物(wu)對(dui)哺乳(ru)動物(wu)乃(nai)至人類的(de)毒(du)作用(yong)（孫(sun)立偉等(deng)，2018）。

易(yi)科泰(tai)生態(tai)技(ji)術(shu)公司(si)提(ti)供(gong)斑馬(ma)魚(yu)呼(hu)吸代謝測(ce)量與(yu)行為(wei)觀測全面(mian)解(jie)決(jue)方(fang)案，能夠在增(zeng)塑(su)劑、農藥(yao)、重金屬、芳香(xiang)族化(hua)合物(wu)、藥(yao)物(wu)等(deng)環(huan)境汙(wu)染(ran)物(wu)對(dui)斑馬(ma)魚(yu)的(de)毒(du)理(li)效應和毒(du)性(xing)機(ji)制研究(jiu)中(zhong)，為(wei)毒(du)理(li)學(xue)科研工(gong)作者(zhe)提供(gong)必要(yao)的(de)生(sheng)理(li)和(he)行為(wei)性(xing)狀數據。涉(she)及(ji)的具體(ti)儀器設(she)備、功(gong)能及(ji)關鍵參數、應用(yong)方(fang)向(xiang)如(ru)下：

模塊(kuai)1. 魚(yu)卵(luan)、胚(pei)胎(tai)、幼魚(yu)高(gao)通(tong)量呼(hu)吸代謝測(ce)量

斑馬(ma)魚(yu)魚(yu)卵(luan)、胚(pei)胎(tai)、幼魚(yu)呼(hu)吸代謝測(ce)量由(you)內置氧(yang)氣(qi)感應貼(tie)片的24孔板、氧氣測(ce)量主(zhu)機(ji)、密(mi)封配(pei)件(jian)等(deng)組成(cheng)，多個(ge)氧(yang)氣測量主(zhu)機(ji)可串(chuan)聯(lian)組成(cheng)最多(duo)240個(ge)通(tong)道的高(gao)通(tong)量測(ce)量系統。

應用(yong)案例(li)：6PPD（輪(lun)胎(tai)抗(kang)氧(yang)化(hua)劑）及(ji)6PPD醌(kun)對(dui)斑馬(ma)魚(yu)幼魚(yu)的(de)毒(du)理(li)效應

        6PPD是在汽車輪(lun)胎(tai)和多種橡膠(jiao)制(zhi)品中(zhong)廣泛(fan)使用的(de)抗(kang)氧(yang)化(hua)劑。挪(nuo)威諾(nuo)德大學(xue)的(de)研究(jiu)人員調查(zha)了6PPD及(ji)6PPD醌(kun)對(dui)斑馬(ma)魚(yu)的(de)急(ji)性(xing)毒(du)性(xing)及(ji)對(dui)其(qi)形(xing)態(tai)、遊(you)泳行為(wei)、心(xin)率和(he)耗氧率的(de)影響(xiang)。發現(xian)環(huan)境相(xiang)關濃度不會造(zao)成(cheng)顯(xian)著(zhu)的(de)毒(du)性(xing)，而(er)亞致死濃(nong)度則會引(yin)起(qi)發育、行為(wei)和(he)心(xin)臟(zang)毒(du)性(xing)(Varshney et al., 2022)。

耗氧(yang)率的(de)測定采(cai)用了高(gao)通(tong)量呼(hu)吸代謝測(ce)量系統：在對(dui)溶解(jie)氧(yang)傳感器進(jin)行兩(liang)點(dian)校準後(hou)，將斑馬(ma)魚(yu)幼魚(yu)放(fang)入(ru)微(wei)孔中(zhong)，每(mei)個(ge)孔(kong)兩(liang)條(tiao)，於(yu)28℃恒(heng)溫條(tiao)件(jian)下測(ce)定。發現(xian)暴露(lu)在PPD及(ji)其(qi)醌(kun)96h的斑馬(ma)魚(yu)幼魚(yu)氧(yang)氣(qi)消耗(hao)相(xiang)比於(yu)對(dui)照組有(you)所(suo)升高(gao)，並存在劑量和(he)時間(jian)依賴性(xing)。

模塊(kuai)2. 成(cheng)魚(yu)呼(hu)吸代謝測(ce)量

斑馬(ma)魚(yu)幼魚(yu)及(ji)成(cheng)魚(yu)呼(hu)吸代謝測(ce)量系統采(cai)用了經(jing)典(dian)的(de)間歇式(shi)(Intermittent flow/stop-flow)測量法(fa)，兼具(ju)高(gao)時間(jian)分(fen)辨率和(he)長(chang)期(qi)監測的特(te)點(dian)。針(zhen)對(dui)斑馬(ma)魚(yu)體(ti)長(chang)短(duan)、體(ti)重輕、耗氧(yang)量低等(deng)特點(dian)，采(cai)用了小(xiao)型(xing)的呼(hu)吸室(shi)、水泵及(ji)非(fei)接(jie)觸式(shi)的光(guang)學(xue)氧(yang)氣(qi)傳感器，確(que)保獲(huo)得(de)可靠的(de)耗氧曲線和(he)耗(hao)氧率數據。系統具(ju)備自(zi)動控制、測量和(he)分(fen)析(xi)的(de)功(gong)能，放(fang)入(ru)斑馬(ma)魚(yu)樣(yang)品、設置間(jian)歇測(ce)量各(ge)階(jie)段的時(shi)間(jian)後(hou)，系統即(ji)可自(zi)動運行和計(ji)算(suan)耗(hao)氧率，研究(jiu)人員也可借(jie)助配(pei)套(tao)軟(ruan)件(jian)計(ji)算(suan)標(biao)準代謝率(SMR)等(deng)數據。

    易(yi)科泰(tai)公司(si)提(ti)供(gong)同時自(zi)主(zhu)集(ji)成(cheng)的斑馬(ma)魚(yu)呼(hu)吸測量系統，可自(zi)動切換(huan)小(xiao)型(xing)水泵的開(kai)閉(bi)狀態(tai)，實(shi)現(xian)了自(zi)動化(hua)間歇式(shi)測量。溶解(jie)氧(yang)監測(ce)采用了熒(ying)光(guang)光(guang)纖(xian)氧(yang)氣(qi)傳感器，具(ju)備高(gao)靈敏(min)度和高(gao)分(fen)辨率，並且(qie)易(yi)安(an)裝、零維(wei)護(hu)。

模塊(kuai)3. 高(gao)通(tong)量視(shi)頻跟(gen)蹤及(ji)行為(wei)分(fen)析(xi)

斑馬(ma)魚(yu)視(shi)頻跟(gen)蹤和(he)行為(wei)分(fen)析(xi)系統由(you)高(gao)清高(gao)幀(zhen)頻工業相(xiang)機(ji)、斑馬(ma)魚(yu)行為(wei)分(fen)析(xi)軟(ruan)件(jian)、斑馬(ma)魚(yu)活動室(shi)/池等(deng)組成(cheng)。先錄(lu)制(zhi)高(gao)質量斑馬(ma)魚(yu)活動視(shi)頻，再在計(ji)算(suan)機(ji)上使用專(zhuan)業行為(wei)分(fen)析(xi)軟(ruan)件(jian)對(dui)視(shi)頻中(zhong)的斑馬(ma)魚(yu)進(jin)行分(fen)析(xi)，獲(huo)得(de)其(qi)隨(sui)時(shi)間變化(hua)的行為(wei)軌跡(ji)（X坐(zuo)標和Y坐(zuo)標；單(dan)條(tiao)斑馬(ma)魚(yu)可做3D跟蹤(zong)，包(bao)括(kuo)X、Y、Z坐(zuo)標），最後(hou)自動計(ji)算(suan)獲(huo)得數十種行為(wei)學(xue)參數。基於(yu)機(ji)器視(shi)覺的(de)斑馬(ma)魚(yu)行為(wei)分(fen)析(xi)系統，能夠對(dui)24孔、48孔、96孔板中(zhong)的斑馬(ma)魚(yu)進(jin)行高(gao)通(tong)量行為(wei)采(cai)集(ji)和分(fen)析(xi)，使研究(jiu)者輕(qing)松獲(huo)得大量行為(wei)數據。

應用(yong)案例(li)：SDHI類殺(sha)菌(jun)劑神經(jing)毒(du)性(xing)機(ji)制研究(jiu)

    啶(ding)酰(xian)菌(jun)胺(an)屬(shu)於(yu)線粒體(ti)呼吸鏈中(zhong)琥珀酸(suan)輔(fu)酶Q 還原(yuan)酶抑(yi)制(zhi)劑（SDHI），是壹(yi)類主(zhu)要(yao)用於(yu)經(jing)濟作物(wu)的廣譜(pu)殺(sha)真(zhen)菌(jun)劑。因其(qi)降解(jie)緩(huan)慢(man)，常(chang)在水樣甚(shen)至(zhi)水生生物(wu)中(zhong)被發現(xian)。中(zhong)國(guo)農(nong)業大學(xue)的(de)研究(jiu)人員為(wei)探(tan)究(jiu)啶(ding)酰(xian)菌(jun)胺(an)的(de)神(shen)經(jing)毒(du)性(xing)機(ji)制，測定了暴露(lu)處理(li)後(hou)的斑馬(ma)魚(yu)幼魚(yu)和(he)成(cheng)魚(yu)的(de)行為(wei)響(xiang)應、組織(zhi)病(bing)理(li)學(xue)、轉錄(lu)組學(xue)、生(sheng)化(hua)參數和基(ji)因(yin)表達。發現(xian)啶(ding)酰(xian)菌(jun)胺(an)可能通(tong)過(guo)損傷正(zheng)常的(de)視(shi)覺和(he)神經(jing)系統功(gong)能影響(xiang)神經(jing)行為(wei)表(biao)現(xian)(Qian, 2021)。

    魚(yu)類行為(wei)測(ce)試是(shi)評估環(huan)境汙(wu)染(ran)物(wu)的神(shen)經(jing)毒(du)性(xing)的(de)有(you)效手段。本研究(jiu)中(zhong)使用了視(shi)頻跟(gen)蹤及(ji)行為(wei)分(fen)析(xi)系統，分(fen)別(bie)對(dui)慢(man)性(xing)暴露(lu)在不(bu)同濃度啶(ding)酰(xian)菌(jun)胺(an)下幼魚(yu)和(he)成(cheng)魚(yu)的(de)活動過(guo)程(cheng)進(jin)行了記錄(lu)，記錄(lu)前(qian)使其(qi)適(shi)應(ying)新環(huan)境10min，持續(xu)記錄(lu)15min後(hou)，對(dui)視(shi)頻文(wen)件(jian)進行分(fen)析(xi)，獲(huo)得(de)了包(bao)括(kuo)速(su)度、加速(su)度、移(yi)動距離(li)和活動時間(jian)等(deng)行為(wei)參數。發現(xian)亞致死濃(nong)度啶(ding)酰(xian)菌(jun)胺(an)慢(man)性(xing)暴露(lu)下的(de)幼魚(yu)以(yi)上4個(ge)行為(wei)參數均整體(ti)降低，並呈時(shi)間劑量依賴性(xing)。而(er)暴露(lu)在高(gao)濃度（1.0mg/L）啶(ding)酰(xian)菌(jun)胺(an)下21天的(de)成(cheng)魚(yu)平(ping)均(jun)速(su)率、加速(su)度受到抑(yi)制(zhi)，但活動時間(jian)和移(yi)動距離(li)顯(xian)著(zhu)增(zeng)加。因(yin)此(ci)，啶(ding)酰(xian)菌(jun)胺(an)慢(man)性(xing)暴露(lu)抑(yi)制(zhi)了斑馬(ma)魚(yu)幼魚(yu)和(he)成(cheng)魚(yu)的(de)運(yun)動能力(li)。

模塊(kuai)4. 遊(you)泳能力(li)

         斑馬(ma)魚(yu)遊(you)泳能力(li)研究(jiu)測試系統為(wei)壹站式方案，包括斑馬(ma)魚(yu)專(zhuan)用(yong)小(xiao)型(xing)遊(you)泳室(shi)和自(zi)動化(hua)水流(liu)速(su)度控制、校準的(de)所(suo)有(you)軟(ruan)硬件(jian)。系統提(ti)供(gong)適(shi)合斑馬(ma)魚(yu)遊(you)泳匹配(pei)的(de)高(gao)精度控制水流(liu)，水流(liu)調節(jie)速(su)度為(wei)0.7 - 50 cm/s。

該系統能夠實現(xian)水流(liu)速(su)度的校準、轉換、校正(zheng)和控制，單(dan)位和(he)方(fang)式任選(xuan)（如(ru)以BL/sec為(wei)單(dan)位的(de)遊(you)泳速(su)度），可對(dui)Solid Blocking效應（斑馬(ma)魚(yu)自身(shen)阻(zu)礙水流(liu)引(yin)起(qi)的(de)水流(liu)速(su)度變化(hua)）進行校正(zheng)，並且(qie)能夠創建(jian)自動化(hua)的用(yong)戶(hu)自(zi)定(ding)義(yi)程(cheng)序(xu)。

模塊(kuai)5：遊(you)泳呼(hu)吸同步(bu)測(ce)定

    遊(you)泳呼(hu)吸同步(bu)測(ce)定系統是(shi)在模塊(kuai)4的基(ji)礎(chu)上添(tian)加了斑馬(ma)魚(yu)間(jian)歇式(shi)呼吸測量功(gong)能，從而(er)實現(xian)了遊(you)泳速(su)度模擬(ni)和(he)活動代謝率測(ce)定的雙(shuang)重功能。

應用(yong)案例(li)：多(duo)環(huan)芳烴(ting)不(bu)同暴露(lu)方式的(de)亞致死效應研究(jiu)

    多環(huan)芳烴(ting)（PAHs）是普(pu)遍(bian)存(cun)在的(de)環(huan)境汙(wu)染(ran)物(wu)，它能夠引(yin)起(qi)多(duo)種魚(yu)類的(de)發育毒(du)性(xing)，但對(dui)成(cheng)年(nian)魚(yu)類急(ji)性(xing)毒(du)性(xing)的研究(jiu)較(jiao)少。為(wei)此(ci)，加拿(na)大薩(sa)斯(si)喀(ka)徹(che)溫大學(xue)毒(du)理(li)學(xue)中(zhong)心的研究(jiu)人員對(dui)斑馬(ma)魚(yu)進(jin)行了兩(liang)種方式(shi)的(de)急性(xing)暴露(lu)——腹腔註射和水環(huan)境暴露(lu)（aqueous exposure），並測定(ding)了心(xin)臟(zang)功(gong)能、代謝率和(he)有(you)氧能力(li)(Gerger, 2015)。後(hou)兩(liang)者使用了遊(you)泳呼(hu)吸同步(bu)測(ce)定系統。

該系統包(bao)括170mL的小(xiao)型(xing)泳道、20L的水浴箱(xiang)和(he)呼(hu)吸代謝測(ce)量模塊(kuai)，使用前(qian)對(dui)溶解(jie)氧(yang)傳感器進(jin)行兩(liang)點(dian)校準，並設定(ding)流(liu)速(su)使斑馬(ma)魚(yu)適(shi)應(ying)90min。之後(hou)以每(mei)20min遞增(zeng)0.077m/s的增(zeng)量提(ti)高(gao)流(liu)速(su)，直(zhi)到斑馬(ma)魚(yu)力(li)竭（停止遊(you)泳最(zui)少2s），最後(hou)根據公式(shi)計(ji)算(suan)臨界(jie)遊(you)泳速(su)度Ucrit。

在測(ce)定(ding)Ucrit過(guo)程(cheng)中(zhong)，采用間(jian)歇式(shi)呼吸測量法(fa)，設定(ding)測(ce)量程(cheng)序(xu)為(wei)“1min交(jiao)換(huan)-4min等(deng)待-5min測量"，直(zhi)到氧氣含(han)量低於(yu)90%空氣(qi)飽(bao)和(he)度。根據耗氧率（MO2）—遊(you)泳速(su)度的非(fei)線性(xing)曲線推(tui)導流(liu)速(su)為(wei)零(ling)時(shi)的(de)耗氧(yang)率，即(ji)為(wei)標(biao)準(zhun)代(dai)謝率SMR。遊(you)泳速(su)度最高(gao)時定(ding)義(yi)為(wei)活動代謝率AMR。根據(ju)代(dai)謝率數據和(he)臨界(jie)遊(you)泳速(su)度計(ji)算(suan)了相(xiang)對(dui)代謝空(kong)間(jian)（F-AS）和單(dan)位距離(li)能耗（COT）。

數據表(biao)明(ming)隨(sui)著(zhe)遊(you)泳速(su)度的增大，所(suo)有(you)處理(li)組MO2顯(xian)著(zhu)增(zeng)大，OCT顯(xian)著(zhu)降(jiang)低。Ucrit無顯(xian)著(zhu)差異(yi)（未展(zhan)示）。不(bu)同劑量的(de)兩(liang)種方式(shi)暴露(lu)後(hou)的斑馬(ma)魚(yu)SMR顯(xian)著(zhu)升(sheng)高(gao)，AMR沒有(you)顯(xian)著(zhu)變化(hua)，F-AS顯(xian)著(zhu)降(jiang)低。以(yi)上結果(guo)表(biao)明兩(liang)種方式(shi)的(de)多環(huan)芳烴(ting)暴露(lu)使斑馬(ma)魚(yu)基(ji)礎(chu)代(dai)謝提(ti)高(gao)以應(ying)對(dui)毒(du)物(wu)暴露(lu)並且(qie)有(you)氧能力(li)減(jian)弱。綜合其(qi)他(ta)方面的(de)數據，發現(xian)多環(huan)芳烴(ting)急(ji)性(xing)暴露(lu)對(dui)成(cheng)年(nian)斑馬(ma)魚(yu)有(you)顯(xian)著(zhu)的(de)亞(ya)致死效應，尤其(qi)會對(dui)斑馬(ma)魚(yu)的(de)有(you)氧能力(li)和心肺(fei)功(gong)能產生負面(mian)影響(xiang)。

參考(kao)文(wen)獻(xian)

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