易(yi)科泰植物(wu)表型成(cheng)像技術(shu)應(ying)用：植物(wu)病(bing)害表型組學(xue)分(fen)析（壹）

自(zi)然(ran)界(jie)中(zhong)的植物(wu)都會面臨(lin)各(ge)種(zhong)病(bing)害的侵染。病(bing)害防治更(geng)是農(nong)業生產中(zhong)的重(zhong)中之重。科學(xue)家們壹直(zhi)致力(li)於用各(ge)種(zhong)技術(shu)研究(jiu)植物(wu)病(bing)害的發(fa)病(bing)機制和防治方法(fa)。在近(jin)年(nian)的最(zui)新(xin)研究(jiu)中(zhong)，新(xin)興的組學(xue)研究(jiu)技術(shu)逐(zhu)漸(jian)成為(wei)病(bing)害研(yan)究(jiu)的熱(re)點。在(zai)各(ge)種(zhong)組學(xue)技術(shu)中，從直(zhi)觀(guan)、無(wu)損(sun)、快(kuai)速(su)、簡(jian)便(bian)以(yi)及(ji)農(nong)業應(ying)用推廣(guang)上考慮(lv)，植物(wu)表型成(cheng)像分(fen)析技術(shu)無疑(yi)是選(xuan)擇(ze)之壹。

傳統表型概念(nian)裏以(yi)形(xing)態(tai)學(xue)指標(biao)為主(zhu)。而(er)現(xian)代植物(wu)表型成(cheng)像分(fen)析技術(shu)已(yi)經(jing)不(bu)局(ju)限(xian)於形態(tai)學(xue)，其(qi)主要(yao)應(ying)用的成(cheng)像技術(shu)如下(xia)，它們在(zai)植物(wu)病(bing)害研(yan)究(jiu)分(fen)別(bie)反(fan)映(ying)植物(wu)的不(bu)同(tong)表型變(bian)化與(yu)生理(li)過(guo)程：

植物(wu)病(bing)害的病(bing)原體(ti)有、細菌(jun)、真(zhen)菌(jun)。而(er)植物(wu)種(zhong)類(lei)又(you)有模式植物(wu)、谷物(wu)、蔬(shu)菜(cai)、水果(guo)等(deng)。植物(wu)表型成(cheng)像分(fen)析技術(shu)能夠(gou)應(ying)對(dui)這些(xie)不(bu)同(tong)的研(yan)究(jiu)需(xu)求(qiu)嗎(ma)？我(wo)們從具(ju)體(ti)的文獻(xian)案(an)例裏查找(zhao)答(da)案，本期(qi)主要(yao)介紹(shao)關(guan)於抗病(bing)毒基(ji)因(yin)、蔬(shu)菜(cai)水果(guo)的葉(ye)片(pian)細菌(jun)病(bing)害相(xiang)關(guan)研究(jiu)案(an)例(li)：

壹、利(li)用模式植物(wu)研(yan)究(jiu)抗病(bing)毒基(ji)因(yin)

法(fa)國(guo)國(guo)家農(nong)業科學(xue)研究(jiu)院(yuan)（INRA）的Jean-Luc Gallois研(yan)究(jiu)團隊(dui)壹直(zhi)致力(li)於馬(ma)鈴(ling)薯(shu)y病(bing)毒組的抗病(bing)基(ji)因(yin)研究(jiu)。這壹病(bing)毒組中(zhong)包括蕪(wu)菁花(hua)葉(ye)病(bing)毒(TuMV)、西(xi)瓜(gua)花葉(ye)病(bing)毒(WMV)、三葉(ye)草(cao)黃(huang)脈病(bing)毒(ClYVV)等(deng)重(zhong)要(yao)的農(nong)作物(wu)病(bing)毒。這方(fang)面(mian)研究(jiu)的難點在(zai)於如何(he)直(zhi)觀(guan)、定(ding)量(liang)地測量(liang)病(bing)毒在植物(wu)樣(yang)品(pin)上的分(fen)布(bu)與(yu)積累(lei)。FluorCam多光(guang)譜熒(ying)光成(cheng)像技術(shu)的出現(xian)解(jie)決了這壹難題(ti)。FluorCam多光(guang)譜熒(ying)光成(cheng)像技術(shu)僅能進(jin)行了葉綠(lv)素熒(ying)光成(cheng)像測量(liang)，也提(ti)供(gong)了關(guan)鍵(jian)的GFP標(biao)記(ji)病(bing)毒活體成(cheng)像(xiang)圖(tu)。GFP成像圖(tu)直(zhi)觀(guan)地(di)表現(xian)病(bing)毒量(liang)的差異(yi)，反(fan)映(ying)了不(bu)同(tong)基(ji)因(yin)功能對(dui)擬(ni)南(nan)芥(jie)病(bing)毒抗性的影(ying)響。同時，葉綠素熒(ying)光成(cheng)像則反映(ying)病(bing)毒對(dui)光合(he)系統的損(sun)傷(shang)，可以(yi)同(tong)步提(ti)供(gong)病(bing)害光(guang)合表型信(xin)息(xi)。

法(fa)國(guo)國(guo)家農(nong)業科學(xue)研究(jiu)院(yuan)利(li)用FluorCam封(feng)閉(bi)式(shi)熒(ying)光成(cheng)像系統，從2015年(nian)起(qi)發(fa)表了壹系(xi)列相關(guan)文章，研究(jiu)方(fang)向包括病(bing)毒的TOR信(xin)號調(tiao)控、跨(kua)物(wu)種(zhong)合(he)成eIF4E1等(deng)位基(ji)因(yin)獲得病(bing)毒抗性、利(li)用CRISPR-Cas9 base editing基(ji)因(yin)編輯技術(shu)模仿eIF4E自(zi)然(ran)多態(tai)性與病(bing)毒抗性的關(guan)系、擬(ni)南(nan)芥(jie)敲(qiao)除eIF4E1獲得(de)ClYVV抗性但又(you)與(yu)TuMV的敏(min)感(gan)性相關(guan)等(deng)。

雖然GFP活(huo)體(ti)成(cheng)像技術(shu)壹般(ban)不(bu)歸(gui)於植物(wu)表型成(cheng)像技術(shu)中，但在病(bing)害研(yan)究(jiu)中(zhong)會經(jing)常利(li)用帶GFP標記(ji)的病(bing)原體(ti)來定(ding)量(liang)分(fen)析感(gan)染面積(ji)與病(bing)毒積累(lei)量(liang)。FluorCam多光(guang)譜熒(ying)光成(cheng)像技術(shu)的GFP活(huo)體(ti)成像(xiang)功能也(ye)廣(guang)泛應(ying)用與其(qi)他病(bing)原體(ti)的指示(shi)測量(liang)。

參(can)考(kao)文獻(xian)：

1.Zafirov D, et al. 2021. When a knockout is an Achilles' heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Pathol. 22: 334–347

2.Bastet A, et al. 2019. Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR‐Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses. Plant Biotechnology Journal 17: 1736–1750

3.Bastet A, et al. 2018. Trans-species synthetic gene design allows resistance pyramiding and broad-spectrum engineering of virus resistance in plants. Plant Biotechnology Journal: 1–13

4.Qin Y, et al. 2019. Purification and Characterization of a Secretory Alkaline Metalloprotease with Highly Potent Antiviral Activity from Serratia marcescens Strain S3. Journal of Agricultural and Food Chemistry 67(11): 3168-3178

二(er)、病(bing)害快(kuai)速(su)無損(sun)檢(jian)測(ce)與抗性品(pin)種(zhong)鑒(jian)定(ding)

對(dui)植物(wu)病(bing)害進(jin)行快(kuai)速(su)檢(jian)測(ce)與早(zao)期(qi)預警(jing)，無損(sun)快(kuai)速(su)的植物(wu)表型成(cheng)像技術(shu)無疑(yi)是好的選(xuan)擇(ze)。但植物(wu)表型組的相(xiang)關(guan)參(can)數(shu)至少(shao)有幾(ji)十項(xiang)，哪壹項(xiang)才是最(zui)準確的呢(ne)？很(hen)多科學(xue)家都進行了相關(guan)的探(tan)索。

德(de)國(guo)萊(lai)布(bu)尼(ni)茨(ci)蔬(shu)菜(cai)和觀(guan)賞(shang)植物(wu)研(yan)究(jiu)所(suo)IGZ將(jiang)剛發(fa)芽(ya)的生(sheng)菜幼(you)苗(miao)感(gan)染了立枯絲核菌(jun)（Rhizoctonia solani），之後使用多種(zhong)表型成(cheng)像分(fen)析技術(shu)測試了各(ge)種(zhong)不(bu)同(tong)參(can)數(shu)，試圖(tu)確定(ding)哪些(xie)技術(shu)的哪(na)個(ge)參(can)數(shu)能夠(gou)更(geng)靈(ling)敏(min)地(di)將感染病(bing)害的植株(zhu)和未感染的植株(zhu)區(qu)分(fen)開。

研究(jiu)中(zhong)進(jin)行成(cheng)像分(fen)析的參(can)數(shu)與所(suo)屬技術(shu)如下(xia)：

1.葉綠(lv)素熒(ying)光成(cheng)像：Fo、Fp、Ft、Fv、最(zui)大光化學(xue)效率(lv)Fv/Fm、熒(ying)光衰減比率(lv)Rfd、光合有效(xiao)葉(ye)面積(ji)日(ri)相(xiang)對(dui)生長(chang)速率(lv)A_abs和A_rel

2.UV-MCF多光(guang)譜熒(ying)光成(cheng)像：F440、F520、F690、F740及(ji)各(ge)個(ge)參(can)數(shu)之間(jian)的比(bi)值

3.紅外(wai)熱成(cheng)像：作物(wu)水脅迫(po)指數(shu)I1、I2、I3、平(ping)均溫度、中值溫度、溫度範(fan)圍

4.反(fan)射光譜成像：R_NIR、R_RED、歸(gui)壹化(hua)植被(bei)指數(shu)NDVI 

成像技術(shu)的另(ling)壹個(ge)優勢(shi)就(jiu)是可(ke)以(yi)同(tong)時(shi)測(ce)量(liang)幾十株乃至上百(bai)株(zhu)幼(you)苗(miao)樣(yang)品(pin)，通過(guo)配(pei)套軟件(jian)就(jiu)能夠(gou)簡(jian)便(bian)地去(qu)除圖(tu)像(xiang)中的背(bei)景，自(zi)動(dong)計(ji)算相(xiang)應(ying)的參(can)數(shu)。

更(geng)為(wei)方(fang)便的是，壹臺(tai)加裝(zhuang)紅外(wai)熱成(cheng)像模塊(kuai)的FluorCam多光(guang)譜熒(ying)光成(cheng)像系統就(jiu)可以(yi)完(wan)成(cheng)所(suo)有上述(shu)參(can)數(shu)的測(ce)量(liang)與成像。

測試結(jie)果(guo)發(fa)現(xian)，感染病(bing)害的植株(zhu)和未感染的植株(zhu)之間(jian)，最(zui)大光化學(xue)效率(lv)Fv/Fm、熒(ying)光衰減比率(lv)Rfd、歸(gui)壹化(hua)植被(bei)指數(shu)NDVI、作物(wu)水脅迫(po)指數(shu)I1、光合(he)有效(xiao)葉(ye)面積(ji)日(ri)相(xiang)對(dui)生長(chang)速率(lv)A_rel、多光(guang)譜熒(ying)光F440、F520等(deng)參(can)數(shu)都表現(xian)出顯著(zhu)差異(yi)。通過(guo)進壹步數(shu)據(ju)統計(ji)分(fen)析最(zui)終發(fa)現(xian)最大(da)光(guang)化(hua)學(xue)效率(lv)Fv/Fm、熒(ying)光衰減比率(lv)Rfd在本次實(shi)驗中的識(shi)別(bie)效(xiao)果(guo)好，≤0.052。Fv/Fm＞0.73的生(sheng)菜幼(you)苗(miao)即(ji)可(ke)認為是健(jian)康(kang)的。Fv/Fm甚(shen)至能夠(gou)在(zai)病(bing)害癥(zheng)狀發(fa)生前(qian)即可(ke)檢(jian)測(ce)到病(bing)菌(jun)感染。研究(jiu)者(zhe)希望通過(guo)進壹步工作，將(jiang)這壹發(fa)現(xian)應(ying)用於園藝(yi)和農業生產實(shi)踐，比如優良(liang)抗病(bing)蔬(shu)菜(cai)品(pin)種(zhong)的選(xuan)育、病(bing)害的早(zao)期(qi)發(fa)現(xian)與防治等(deng)。

浙江大(da)學(xue)同時(shi)使用FluorCam熒(ying)光成(cheng)像系統對(dui)柑橘(ju)黃(huang)龍(long)病(bing)進行了檢(jian)測(ce)分(fen)析。研(yan)究(jiu)者(zhe)通過(guo)對(dui)健(jian)康(kang)葉(ye)片(pian)、感(gan)染黃(huang)龍(long)病(bing)葉片(pian)和養(yang)分(fen)缺(que)乏葉片(pian)進(jin)行葉(ye)綠素熒(ying)光成(cheng)像分(fen)析，確定(ding)了黃(huang)龍(long)病(bing)的熒(ying)光標(biao)誌(zhi)，即“光(guang)合(he)指紋(wen)"，結(jie)合葉(ye)綠素熒(ying)光參(can)數(shu)與成像圖(tu)，對(dui)葉片(pian)黃(huang)龍(long)病(bing)取(qu)得了最佳識(shi)別(bie)分(fen)類(lei)效果(guo)，準(zhun)確率(lv)達(da)到97%。

參(can)考(kao)文獻(xian)：

1.Sandmann M, et al. 2018. The use of features from fluorescence, thermography and NDVI imaging to detect biotic stress in lettuce. Plant Disease 102: 1101-1107

2.Weng H, et al. 2020. Characterization and detection of leaf photosynthetic response to citrus Huanglongbing from cool to hot seasons in two orchards. Transactions of the ASABE 63(2): 501-512

北京易科泰生(sheng)態技術(shu)公(gong)司(si)提(ti)供(gong)植物(wu)病(bing)害表型全(quan)面技術(shu)方案(an)：

1.FluorCam葉(ye)綠素熒(ying)光/多光(guang)譜熒(ying)光技術(shu)

2.PlantScreen植物(wu)高(gao)通量(liang)表型成(cheng)像分(fen)析平(ping)臺(tai)

3.FluorPen手持(chi)式(shi)葉(ye)綠(lv)素熒(ying)光儀、SpectraPen手持(chi)式(shi)植物(wu)高(gao)光(guang)譜儀

4.PhenoPlot®輕便型植物(wu)表型成(cheng)像分(fen)析系(xi)統

5.PhenoPlot®懸浮雙軌(gui)式表型成(cheng)像分(fen)析系(xi)統

6.PhenoTron®-HSI多功(gong)能高(gao)光(guang)譜成(cheng)像分(fen)析系(xi)統

7.PhenoTron®復式(shi)智(zhi)能LED光源(yuan)培養(yang)與光(guang)譜成(cheng)像分(fen)析平(ping)臺(tai)

8.PhenoTron®PTS植物(wu)光(guang)譜(pu)成像分(fen)析平(ping)臺(tai)

9.PhenoTron®-XYZ表型成(cheng)像分(fen)析系(xi)統