如何(he)選(xuan)配適(shi)用(yong)的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)？看(kan)這(zhe)壹(yi)篇(pian)就夠(gou)了

葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術已(yi)成為研(yan)究(jiu)植物光(guang)合(he)生理(li)、表(biao)型(xing)分(fen)析(xi)等的儀(yi)器(qi)技術，如今(jin)市(shi)面(mian)上(shang)有(you)很多(duo)自稱可以進(jin)行(xing)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)的設(she)備(bei)，既(ji)有(you)進(jin)口的，也(ye)有(you)國(guo)產的，其(qi)中不(bu)乏(fa)存(cun)在(zai)壹(yi)些(xie)忽(hu)悠(you)、故(gu)弄玄(xuan)虛、產品(pin)不成熟(shu)甚(shen)至(zhi)存(cun)在(zai)嚴重缺陷(xian)並(bing)不(bu)被學術界(jie)認(ren)可（沒(mei)有(you)參考文獻做(zuo)支(zhi)撐(cheng)甚(shen)至(zhi)根本沒(mei)有(you)參考文獻）等問(wen)題(ti)，宣傳(chuan)彩(cai)頁(ye)或(huo)者(zhe)含糊(hu)其(qi)辭、或(huo)者(zhe)亂(luan)加引用(yong)其(qi)它儀(yi)器(qi)技術的參考文獻圖片、甚(shen)至(zhi)作假圖(tu)片等。如果購(gou)買(mai)了這(zhe)樣的儀(yi)器(qi)設(she)備(bei)，實驗(yan)成果很可能存(cun)在(zai)錯誤(wu)或(huo)漏(lou)洞和誤(wu)導(dao)、很難在國際(ji)學(xue)術(shu)期(qi)刊(kan)上(shang)發表(biao)等(deng)問題(ti)。本(ben)文主要(yao)針(zhen)對(dui)葉綠素(su)熒(ying)光動(dong)態(tai)成像(xiang)技術，就(jiu)如何(he)選(xuan)配葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)設(she)備(bei)問(wen)題(ti)做(zuo)壹(yi)簡單介(jie)紹，所介(jie)紹的儀(yi)器(qi)設(she)備(bei)都是國際(ji)上(shang)學(xue)術(shu)界(jie)普遍采(cai)用的、每(mei)年(nian)都借以發表(biao)大(da)量文獻(xian)、被學術界(jie)廣(guang)泛認(ren)可的技術產品(pin)。

壹(yi)、 葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術的發展(zhan)

1. 傳(chuan)統葉(ye)綠素(su)熒(ying)光儀

20世(shi)紀八(ba)九(jiu)十(shi)年代，葉綠素(su)熒(ying)光檢測技術逐漸(jian)成熟(shu)。目前(qian)主流(liu)的商(shang)用葉(ye)綠素(su)熒(ying)光儀主要(yao)有(you)以下三(san)大(da)技術路(lu)線：

（1）連(lian)續激(ji)發式（非調制式）熒光(guang)儀Direct Fluorometer，測量OJIP快(kuai)速(su)熒(ying)光(guang)曲(qu)線

（2）脈(mai)沖(chong)調制式熒光(guang)儀Pulse Amplitude Modulated Fluorometer，測量穩態(tai)熒(ying)光與熒(ying)光淬滅(mie)曲(qu)線

（3）雙(shuang)調制式熒光(guang)儀Double-Modulation Fluorometer，時(shi)間(jian)分(fen)辨率(lv)2μs，測量快(kuai)速(su)熒(ying)光(guang)誘導曲(qu)線，如QA–再(zai)氧(yang)化(hua)動(dong)力(li)學曲(qu)線、S-state狀態轉(zhuan)換等(deng)，同時(shi)兼(jian)容(rong)調制式與連(lian)續激(ji)發式

    其(qi)中FL6000（原(yuan)FL3500）雙(shuang)調制式葉綠素(su)熒(ying)光儀無疑(yi)是目前(qian)功(gong)能全(quan)面(mian)、性(xing)能好(hao)的壹(yi)類(lei)葉綠素(su)熒(ying)光儀。可以在(zai)手持(chi)式小(xiao)型(xing)儀器(qi)（FluorPen/AquaPen）中(zhong)融(rong)合(he)PAM脈(mai)沖(chong)調制和OJIP兩(liang)類測量技術，並(bing)集成PAR光(guang)合(he)有效(xiao)輻射和OD光(guang)密(mi)度傳(chuan)感(gan)器(qi)，甚(shen)至(zhi)可以在(zai)國際(ji)空間站(zhan)上(shang)進(jin)行(xing)科研工作。

2. 葉(ye)綠素(su)熒(ying)光儀的局(ju)限(xian)性(xing)

在(zai)多(duo)年(nian)的儀(yi)器(qi)使(shi)用研(yan)究(jiu)之(zhi)後，科學家(jia)們逐漸(jian)發現了(le)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光儀有(you)壹(yi)些(xie)難以解(jie)決的局(ju)限(xian)性(xing)。

（1）葉(ye)綠素(su)熒(ying)光儀僅(jin)能通(tong)過(guo)光纖測量樣品(pin)的壹(yi)個點，無法(fa)展(zhan)示樣品(pin)不同部(bu)位(wei)、結(jie)構(gou)的差(cha)異，更難(nan)以研(yan)究脅迫受損(sun)組(zu)織(zhi)的分(fen)布(bu)以及受損(sun)部(bu)分(fen)和健(jian)康(kang)部分(fen)的差(cha)異。測量結(jie)果還(hai)容(rong)易(yi)因為不同部(bu)位(wei)間的差(cha)異造(zao)成誤差(cha)。

（2）熒(ying)光(guang)儀只能獲(huo)得(de)熒光數(shu)據和動(dong)力(li)學曲(qu)線圖(tu)，難(nan)以展(zhan)現實驗(yan)處理(li)在(zai)樣(yang)品(pin)上(shang)的分(fen)布(bu)情(qing)況。

（3）熒(ying)光(guang)儀要求(qiu)測量樣品(pin)盡量平(ping)整，基本上(shang)只能測量葉片或(huo)者(zhe)藻液，很難測量果實、花朵、果穗(sui)、種(zhong)子、特殊(shu)植物器(qi)官(guan)（如捕(bu)蟲(chong)器(qi)官(guan)）、整株(zhu)植物和冠(guan)層等，微觀(guan)上(shang)也(ye)不(bu)能測量單個微藻或(huo)植物細(xi)胞(bao)乃(nai)至單個葉綠體(ti)。

（4）面(mian)對(dui)大(da)量小(xiao)型(xing)樣品(pin)時，使(shi)用(yong)熒光儀(yi)壹(yi)次只能測量壹(yi)個樣品(pin)，工作(zuo)量極大(da)；而且很難直(zhi)觀(guan)比對(dui)樣品(pin)間的差(cha)異。

3. 葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術的出(chu)現與(yu)成熟(shu)

隨(sui)著(zhe)Charge-Coupled Device(CCD)相(xiang)機(ji)技術、電(dian)腦圖(tu)像(xiang)分(fen)析(xi)技術以及LED光(guang)源板(ban)技術的成熟(shu)，從上(shang)世(shi)紀八(ba)十(shi)年代末開(kai)始，葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術開(kai)始逐漸(jian)發展(zhan)起來(lai)（Daley et al.1989; Raschke et al. 1990; Mott et al. 1993; Genty and Meyer 1994; Bro et al. 1995; Siebke and Weis 1995; Meyer and Genty 1998; Balachandran et al. 1994; Oxborough and Baker 1997；Nedbal 2004）。但(dan)這(zhe)些(xie)研究(jiu)壹(yi)直(zhi)局限(xian)於(yu)研(yan)究(jiu)者(zhe)實驗(yan)室(shi)使用，難以商(shang)業(ye)推(tui)廣(guang)，技術上(shang)也(ye)不(bu)成熟(shu)。

Ladislav Nedbal與(yu)Martin Trtilek等(deng)於(yu)20世(shi)紀90年(nian)代(dai)末期發明了(le)與(yu)PAM技術相(xiang)結(jie)合(he)的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術（他(ta)們同時(shi)也(ye)是FL6000雙(shuang)調制式葉綠素(su)熒(ying)光技術的發明者(zhe)），研(yan)制成功(gong)了第壹(yi)臺(tai)FluorCam脈(mai)沖(chong)調制式葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)（Nedbal，2000）並(bing)推(tui)出(chu)其(qi)商(shang)用型(xing)號。無論(lun)是葉綠素(su)熒(ying)光書籍(ji)《Chlorophyll a fluorescence: a signature of photosynthesis》（Nedbal也(ye)是本書(shu)的合(he)作作(zuo)者(zhe)之(zhi)壹(yi)），還(hai)是引用(yong)次數(shu)高(gao)達4600的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光研究(jiu)綜(zong)述《Chlorophyll Fluorescence: A Probe of Photosynthesis In Vivo》都將FluorCam調制式葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術的出(chu)現作(zuo)為(wei)葉綠素(su)熒(ying)光研究(jiu)真(zhen)正進入(ru)二(er)維時代(dai)的裏程(cheng)碑(bei)。之(zhi)後又(you)出(chu)現了(le)多(duo)個葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)商(shang)用儀(yi)器(qi)，其(qi)中有(you)些(xie)品(pin)牌現在(zai)已(yi)經銷聲匿(ni)跡。而FluorCam還(hai)壹(yi)直(zhi)是葉綠素(su)熒(ying)光研究(jiu)的優(you)中之(zhi)選(xuan)，更(geng)是愈來(lai)愈發展(zhan)壯(zhuang)大(da)，已(yi)成為植物光(guang)合(he)生理(li)與(yu)表(biao)型(xing)分(fen)析(xi)研究儀(yi)器(qi)。 

二(er)、 如何(he)選(xuan)配葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)系(xi)統

在(zai)選(xuan)配儀器(qi)時(shi)，我(wo)們(men)都要考慮這(zhe)樣兩(liang)個相互(hu)關(guan)聯的問(wen)題(ti)：

如何(he)根(gen)據實驗(yan)設(she)計(ji)選(xuan)擇適用的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)的型(xing)號和配(pei)置？

如何(he)分(fen)辨葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)的優(you)劣？

那(na)麽(me)，面對(dui)廠家(jia)的宣(xuan)傳(chuan)，我(wo)們(men)應(ying)該(gai)如何(he)確(que)定真(zhen)正(zheng)技術優(you)秀又(you)適(shi)用(yong)於(yu)自己的儀(yi)器(qi)呢(ne)？我(wo)們(men)可以從以下四點(dian)逐壹(yi)考察：

文(wen)獻(xian)發表(biao)情(qing)況

成像(xiang)質(zhi)量：熒光(guang)激(ji)發光(guang)源、成像(xiang)傳(chuan)感(gan)器(qi)與(yu)實際(ji)成像(xiang)圖(tu)

軟(ruan)件功(gong)能：測量參數(shu)及對(dui)應(ying)成像(xiang)圖(tu)處理(li)、無人(ren)值(zhi)守(shou)自動(dong)測量等(deng)

擴(kuo)展(zhan)成像(xiang)功(gong)能

1. 文(wen)獻(xian)發表(biao)情(qing)況

在(zai)進(jin)行(xing)實驗(yan)設(she)計(ji)之(zhi)前(qian)，我(wo)們(men)都需要(yao)閱讀大(da)量的文(wen)獻(xian)。這(zhe)不但(dan)是為了(le)從前(qian)人(ren)的研(yan)究(jiu)中(zhong)獲(huo)得實驗(yan)思(si)路(lu)和靈(ling)感(gan)，也(ye)是為了(le)從文獻(xian)中(zhong)發現測量數(shu)據精確可靠(kao)、國(guo)際(ji)認(ren)可度(du)高(gao)的儀(yi)器(qi)。這(zhe)從發表(biao)文(wen)獻的數(shu)量和質(zhi)量上(shang)可以有(you)壹(yi)個直(zhi)觀(guan)的認(ren)識(shi)。

2019年(nian)-2021年(nian)，每(mei)年使用(yong)FluorCam葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術發表(biao)的SCI文(wen)獻(xian)都保持(chi)在150篇(pian)以上(shang)。2022年(nian)更(geng)是達到200篇(pian)以上(shang)。其(qi)中國(guo)內科研院(yuan)所利(li)用FluorCam發表(biao)文(wen)獻量占比也(ye)在(zai)逐年攀(pan)升(sheng)。這(zhe)既說(shuo)明中(zhong)國(guo)科學家(jia)對(dui)FluorCam葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術有(you)認(ren)可度(du)。 

這(zhe)些(xie)發表(biao)的文(wen)獻(xian)中(zhong)，中(zhong)科院(yuan)SCI期(qi)刊(kan)分(fen)區壹(yi)區(qu)文獻（按文(wen)獻(xian)發表(biao)當(dang)年的中(zhong)科院(yuan)SCI期(qi)刊(kan)分(fen)區進(jin)行(xing)統(tong)計(ji)）數(shu)量同樣(yang)穩(wen)中有(you)進。2020年(nian)至(zhi)2023年(nian)5月(yue)，壹(yi)區(qu)文獻發表(biao)量占同期(qi)全(quan)部發表(biao)文(wen)獻量的30%。這(zhe)其(qi)中包(bao)括發表(biao)於(yu)The Plant Cell、Nature Communications、Nature Plants、Cell、PNAS、Molecular Plant、New Phytologist、Plant Physiology等(deng)頂(ding)級期(qi)刊(kan)的文(wen)獻(xian)。說(shuo)明FluorCam技術發表(biao)文(wen)獻的研(yan)究(jiu)水(shui)平(ping)之(zhi)高(gao)。 

2. 成像(xiang)質(zhi)量：熒光(guang)激(ji)發光(guang)源、成像(xiang)傳(chuan)感(gan)器(qi)、實際(ji)成像(xiang)圖(tu)

（1）熒(ying)光(guang)激發光(guang)源：光質(zhi)（顏(yan)色）、成像(xiang)面(mian)積(ji)、光強、光(guang)場(chang)均(jun)勻(yun)度

葉(ye)綠素(su)熒(ying)光測量必須要(yao)用(yong)專(zhuan)門(men)的熒(ying)光(guang)激(ji)發光(guang)源來(lai)激發熒(ying)光(guang)。根據(ju)用(yong)途，激發光(guang)分(fen)為測量光、光(guang)化(hua)學光(guang)和飽(bao)和脈(mai)沖(chong)光(guang)。在(zai)目(mu)前(qian)主流(liu)的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)中(zhong)，這(zhe)些(xie)激發光(guang)都來(lai)源於(yu)儀(yi)器(qi)配(pei)備的LED光(guang)源板(ban)。

從光質(zhi)（顏(yan)色）上(shang)來(lai)說，從紫外(wai)光到紅(hong)光(guang)都可以激(ji)發葉(ye)綠素(su)熒(ying)光。但(dan)光合(he)色素(su)（包(bao)括天線色素(su)和光(guang)反(fan)應(ying)中(zhong)心(xin)的葉(ye)綠素(su)a）有(you)其(qi)特定(ding)的吸(xi)收(shou)峰，因(yin)此(ci)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光儀器(qi)壹(yi)般(ban)使(shi)用(yong)的光(guang)質(zhi)為(wei)：

紅(hong)光(guang)、藍(lan)光：對(dui)應(ying)葉(ye)綠素(su)和類(lei)胡(hu)蘿蔔素(su)的吸(xi)收(shou)峰，也(ye)可用(yong)於(yu)研(yan)究(jiu)植物對(dui)不同光(guang)質(zhi)的響(xiang)應(ying)

白(bai)光(guang)：模(mo)擬(ni)自然光(guang)；兼(jian)顧(gu)各種(zhong)光合(he)色素(su)

其(qi)他波段(duan)光(guang)源：針(zhen)對(dui)特定(ding)樣品(pin)，比如紅(hong)藻(zao)、褐藻等可選(xuan)用(yong)590 nm琥珀(po)光

具體(ti)到每(mei)種(zhong)激發光(guang)，測量光是用來(lai)測量最小(xiao)熒(ying)光F₀，而在激(ji)發F₀時(shi)，要(yao)求(qiu)光反(fan)應(ying)中(zhong)心(xin)不產生(sheng)電荷(he)分(fen)離和熱耗散(san)，因(yin)此能級較(jiao)低的紅(hong)光(guang)就(jiu)是選擇。飽和脈(mai)沖(chong)光(guang)用(yong)來(lai)暫時(shi)關(guan)閉光(guang)系(xi)統反(fan)應(ying)中(zhong)心(xin)，因此高(gao)能級的藍(lan)光或(huo)全(quan)光譜的白(bai)光(guang)更(geng)為(wei)合(he)適。光(guang)化(hua)學光(guang)用來(lai)在測量過程(cheng)中誘導植物發生(sheng)光(guang)合(he)作用(yong)，也(ye)就(jiu)是模(mo)擬(ni)自然光(guang)照(zhao)，因此(ci)紅(hong)光(guang)藍(lan)光均(jun)可，但(dan)光質(zhi)無疑(yi)還(hai)是更接(jie)近(jin)真實自然光(guang)照(zhao)的白(bai)光(guang)。

由此推薦(jian)的光(guang)源配置如下（有的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)只能配(pei)備(bei)壹(yi)種(zhong)顏(yan)色的光(guang)源，那就(jiu)沒(mei)有(you)辦法(fa)了）：

測量光：紅(hong)光(guang)

光(guang)化(hua)光：紅(hong)光(guang)、藍(lan)光或(huo)白(bai)光（至(zhi)少(shao)壹(yi)種(zhong)，可配(pei)多(duo)種(zhong)，白光(guang)更(geng)接(jie)近(jin)真實條件）

飽(bao)和脈(mai)沖(chong)光(guang)：白(bai)光(guang)或(huo)藍(lan)光（壹(yi)般(ban)壹(yi)種(zhong)即可）

FluorCam可以在(zai)壹(yi)臺(tai)儀器(qi)中(zhong)同時(shi)配(pei)備紅(hong)光(guang)+白(bai)光(guang)和紅(hong)光(guang)+藍(lan)光的雙(shuang)色(se)光(guang)源，還可以定(ding)制青(qing)光(guang)、綠光(guang)、琥珀(po)光、深(shen)紅(hong)光(guang)、紫(zi)外(wai)光等(deng)各種(zhong)不同光(guang)質(zhi)的光(guang)源，而且每種(zhong)光源均(jun)為(wei)專用(yong)的均(jun)勻(yun)陣列光源板(ban)。

同時(shi)，光(guang)源板(ban)的面(mian)積(ji)又(you)是最佳成像(xiang)面(mian)積(ji)的決定因(yin)素(su)。FluorCam系(xi)統具備壹(yi)系(xi)列不(bu)同成像(xiang)面(mian)積(ji)的型(xing)號，從用來(lai)進行(xing)細(xi)胞(bao)級微觀(guan)熒光(guang)測量的顯(xian)微鏡，到進(jin)行(xing)大(da)型(xing)作物與冠(guan)層測量35×35cm成像(xiang)面(mian)積(ji)的大(da)型(xing)平(ping)臺(tai)，均(jun)配(pei)備的專(zhuan)門(men)對(dui)應(ying)設(she)計(ji)的LED光(guang)源板(ban)。

而光強(qiang)、面(mian)積、光場(chang)均(jun)勻(yun)度這(zhe)三(san)個方面(mian)是相互(hu)聯系(xi)的。光(guang)化(hua)學光(guang)壹(yi)般(ban)要(yao)求(qiu)最高(gao)達到1500-2000 µmol/m².s，飽(bao)和脈(mai)沖(chong)光(guang)壹(yi)般(ban)要(yao)求(qiu)最高(gao)達到3000-5000 µmol/m².s。但(dan)由於(yu)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)是在壹(yi)個二(er)維空間上(shang)進(jin)行(xing)同步(bu)檢測的，因(yin)此(ci)就(jiu)要(yao)求(qiu)在壹(yi)定(ding)的成像(xiang)面(mian)積(ji)上(shang)達到足夠(gou)的光(guang)場(chang)均(jun)勻(yun)度。那(na)麽(me)這(zhe)個光場(chang)均(jun)勻(yun)又(you)能保(bao)證(zheng)足夠(gou)光強(qiang)的成像(xiang)面(mian)積(ji)是由什麽決定的？這(zhe)絕不(bu)是廠家(jia)宣傳(chuan)資料上(shang)隨(sui)便(bian)說的，這(zhe)需要(yao)壹(yi)系(xi)列軟(ruan)硬件技術的支(zhi)持(chi)。

首(shou)先(xian)，點光源的光(guang)場(chang)必然會隨距離(li)衰減(jian)。因(yin)此(ci)對(dui)於(yu)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)使(shi)用的光(guang)源板(ban)必須是均(jun)勻(yun)排列(lie)的LED陣列，而且每塊LED光(guang)源板(ban)的面(mian)積(ji)至(zhi)少(shao)要(yao)和成像(xiang)面(mian)積(ji)壹(yi)樣(yang)大(da)。這(zhe)樣點(dian)光(guang)源陣列的光(guang)場(chang)疊(die)加才(cai)能保(bao)證(zheng)相(xiang)同成像(xiang)面(mian)積(ji)中的光(guang)場(chang)是均(jun)勻(yun)的。如果光(guang)源陣列本身就不(bu)是均(jun)勻(yun)的，那(na)麽(me)怎(zen)麽(me)可能保(bao)證(zheng)光(guang)場(chang)是均(jun)勻(yun)的呢(ne)？

但(dan)由於(yu)光(guang)源光場(chang)的邊(bian)際(ji)效(xiao)應(ying)，僅(jin)僅(jin)這(zhe)樣還(hai)是不夠(gou)的。為(wei)了(le)獲(huo)得(de)更好(hao)的成像(xiang)效(xiao)果還(hai)需(xu)要有(you)更進壹(yi)步(bu)的技術保(bao)障。壹(yi)種(zhong)方法(fa)是使用(yong)兩(liang)塊同等(deng)面(mian)積的LED光(guang)源板(ban)各自斜(xie)向45°相(xiang)對(dui)排列(lie)，使同等(deng)面(mian)積上(shang)疊(die)加的LED數(shu)量提高(gao)壹(yi)倍。比如FluorCam開(kai)放式和封(feng)閉(bi)式葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)系(xi)統就(jiu)是使用(yong)這(zhe)種(zhong)方法(fa)，4塊(kuai)13×13或(huo)20×20cm的光(guang)源板(ban)兩(liang)兩(liang)成組，保(bao)證(zheng)相(xiang)應(ying)成像(xiang)面(mian)積(ji)中光場(chang)的均(jun)勻(yun)度。另(ling)壹(yi)種(zhong)方法(fa)是增加光源板(ban)的面(mian)積(ji)。比如FluorCam大(da)型(xing)葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)平(ping)臺(tai)使(shi)用(yong)大(da)於(yu)70×70cm的光(guang)源板(ban)來(lai)確保成像(xiang)中(zhong)心(xin)35×35cm的光(guang)場(chang)均(jun)勻(yun)度。

（2）成像(xiang)傳(chuan)感(gan)器(qi)

目(mu)前(qian)主要(yao)的成像(xiang)傳(chuan)感(gan)器(qi)有(you)CCD和CMOS兩(liang)種(zhong)。兩(liang)種(zhong)傳(chuan)感(gan)器(qi)各(ge)有優(you)劣。目前(qian)，熒(ying)光(guang)成像(xiang)類(lei)儀(yi)器(qi)是以CCD傳(chuan)感(gan)器(qi)為(wei)主。

成像(xiang)傳(chuan)感(gan)器(qi)有(you)兩(liang)個關(guan)鍵(jian)技術指標：圖像(xiang)分(fen)辨率(lv)與(yu)成像(xiang)速(su)度(du)。更高(gao)的圖(tu)像(xiang)分(fen)辨率(lv)能夠(gou)獲得(de)更清(qing)晰的熒(ying)光(guang)成像(xiang)圖(tu)。那(na)麽成像(xiang)速(su)度(du)的重要性(xing)在哪(na)裏呢(ne)？

葉(ye)綠素(su)熒(ying)光是壹(yi)種(zhong)比較(jiao)特殊(shu)的熒(ying)光(guang)，由於(yu)它(ta)的強(qiang)度(du)與(yu)光(guang)合(he)電子傳(chuan)遞(di)鏈的生(sheng)理(li)狀態密(mi)切相(xiang)關(guan)，在測量過程(cheng)中會快(kuai)速(su)而劇(ju)烈的變化(hua)，其(qi)強度(du)的變化(hua)曲(qu)線被稱為葉綠素(su)熒(ying)光動(dong)力(li)學曲(qu)線。從數(shu)據的準(zhun)確(que)度(du)上(shang)考慮，成像(xiang)速(su)度(du)直(zhi)接(jie)關(guan)系(xi)到CCD能夠(gou)靈(ling)敏捕(bu)捉到曲(qu)線的動(dong)態(tai)變化(hua)。因此(ci)，CCD成像(xiang)速(su)度(du)的重要性(xing)還要(yao)高(gao)於(yu)圖(tu)像(xiang)分(fen)辨率(lv)。

而這(zhe)兩(liang)項技術參數(shu)是有壹(yi)定(ding)的相(xiang)互(hu)影(ying)響(xiang)的。壹(yi)般(ban)來(lai)說，圖像(xiang)分(fen)辨率(lv)過(guo)大(da)，必然會降低成像(xiang)速(su)度(du)。因此在(zai)這(zhe)兩(liang)者之(zhi)間，需(xu)要取得壹(yi)個平(ping)衡(heng)。有的CCD傳(chuan)感(gan)器(qi)為(wei)了解(jie)決這(zhe)壹(yi)問(wen)題，采(cai)用了(le)binning像(xiang)素(su)合(he)並(bing)的數(shu)據處理(li)方(fang)式，就是將壹(yi)定(ding)數(shu)量（2的n次方(fang)）的像(xiang)素(su)點(dian)合(he)並(bing)為(wei)壹(yi)個像(xiang)素(su)點(dian)輸出(chu)數(shu)據，從而提高(gao)成像(xiang)速(su)度(du)，但(dan)實際(ji)獲(huo)得(de)成像(xiang)圖(tu)的分(fen)辨率(lv)也(ye)要(yao)降低同樣(yang)的倍數(shu)。

某(mou)品(pin)牌葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)宣(xuan)稱其(qi)圖像(xiang)分(fen)辨率(lv)為(wei)1392×1040像(xiang)素(su)，成像(xiang)速(su)度(du)為30幀/秒。但(dan)實際(ji)上(shang)1392×1040像(xiang)素(su)是在1×1 binning模(mo)式下，而30幀/秒則(ze)是在2×2 binning模(mo)式下。其(qi)在測量葉綠素(su)熒(ying)光時為(wei)了(le)確保成像(xiang)速(su)度(du)，只能在(zai)2×2 binning模(mo)式下測量，最後得到的成像(xiang)圖(tu)只有(you)696×520（1392/2×1040/2）。FluorCam則(ze)可以在(zai)1360×1024的圖(tu)像(xiang)分(fen)辨率(lv)下確保(bao)20幀/秒的成像(xiang)速(su)度(du)。這(zhe)是經過反(fan)復(fu)測試(shi)後獲得(de)的最佳平(ping)衡(heng)。

（3）實際(ji)成像(xiang)圖(tu)

有(you)的老(lao)師(shi)可能發現，某(mou)些(xie)品(pin)牌的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)宣(xuan)傳(chuan)資料上(shang)的成像(xiang)圖(tu)絢麗多(duo)彩(cai)、搖曳生(sheng)姿(zi)。但(dan)其(qi)發表(biao)文(wen)獻中(zhong)的成像(xiang)圖(tu)卻是模(mo)模(mo)糊(hu)糊(hu)壹(yi)大(da)團(tuan)，不要說像(xiang)FluorCam這(zhe)樣分(fen)辨出(chu)葉肉(rou)和葉(ye)脈(mai)，甚(shen)至(zhi)連(lian)病斑、老葉(ye)幼(you)葉(ye)都無法(fa)區分(fen)。從CCD和光(guang)源的技術參數(shu)上(shang)看(kan)起(qi)來(lai)沒(mei)有(you)什麽問(wen)題啊？這(zhe)是什麽原(yuan)因(yin)？ 

我(wo)們(men)先不(bu)考慮虛假宣(xuan)傳(chuan)的問(wen)題(ti)，只從技術的角(jiao)度(du)來(lai)分(fen)析(xi)壹(yi)下這(zhe)個問題(ti)的原(yuan)因(yin)。

目(mu)前(qian)的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術實際(ji)上(shang)是特指PAM脈(mai)沖(chong)調制式葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術。只是對(dui)葉綠素(su)熒(ying)光進行(xing)簡單地(di)成像(xiang)是沒(mei)有(you)什麽技術難(nan)度的。但(dan)是，只有(you)通(tong)過(guo)PAM脈(mai)沖(chong)調制技術才(cai)能獲(huo)得(de)真正準(zhun)確(que)的熒(ying)光(guang)成像(xiang)圖(tu)與(yu)對(dui)應(ying)的數(shu)據。

PAM，即(ji)Pulse Amplitude Modulation脈(mai)沖(chong)振幅(fu)調制或(huo)脈(mai)幅(fu)調制。PAM實際(ji)上(shang)是壹(yi)種(zhong)信號檢測方(fang)式。PAM脈(mai)沖(chong)調制式葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)在(zai)工作(zuo)時(shi)，測量光按照(zhao)壹(yi)定(ding)的調制頻率，以閃(shan)爍的光(guang)脈(mai)沖(chong)形式照射(she)植物樣(yang)品(pin)，成像(xiang)CCD與(yu)測量光要(yao)進(jin)行(xing)嚴格地(di)脈(mai)沖(chong)調制，即只記錄(lu)測量光激(ji)發的、與(yu)測量光同頻的熒(ying)光(guang)信(xin)號。

葉(ye)綠素(su)熒(ying)光測量應(ying)用(yong)PAM技術的目(mu)的是：

調制後的測量光不(bu)會激發光(guang)反(fan)應(ying)中(zhong)心(xin)電荷(he)分(fen)離，從而測量真實的F₀

能夠(gou)測量光適(shi)應(ying)條(tiao)件（開(kai)啟(qi)光(guang)化(hua)光）下的熒(ying)光(guang)，從而獲得(de)完(wan)整的熒(ying)光(guang)淬(cui)滅(mie)動(dong)力(li)學曲(qu)線，計(ji)算(suan)相關(guan)參數(shu)，如QY、NPQ、qP、Rfd、ETR等(deng)

那(na)麽(me)如果壹(yi)臺(tai)葉綠素(su)熒(ying)光儀器(qi)不(bu)是真正(zheng)的PAM脈(mai)沖(chong)調制技術會怎(zen)麽(me)樣(yang)呢(ne)？不(bu)但(dan)成像(xiang)圖(tu)質(zhi)量大(da)打(da)折(zhe)扣，同時(shi)由於(yu)最基本的最小(xiao)熒(ying)光F₀（也(ye)稱(cheng)為原(yuan)初熒光，可以認(ren)為(wei)是葉綠素(su)熒(ying)光的本(ben)底值(zhi)）無法(fa)測準(zhun)，後續所(suo)有(you)基於(yu)F₀計(ji)算(suan)的熒(ying)光(guang)參數(shu)全部(bu)都不可靠(kao)。這(zhe)樣的儀(yi)器(qi)就(jiu)算(suan)是發表(biao)了(le)文獻(xian)，經常會出(chu)現超(chao)出(chu)葉綠素(su)熒(ying)光參數(shu)理(li)論(lun)範圍的結(jie)果。這(zhe)樣的數(shu)據結(jie)果和成像(xiang)圖(tu)又(you)如何(he)支(zhi)持(chi)實驗(yan)研(yan)究的結(jie)論(lun)呢(ne)？

所(suo)以說(shuo)，不看廣(guang)告看療(liao)效(xiao)。我(wo)們(men)不能壹(yi)味(wei)地(di)相信廠家(jia)標稱的技術參數(shu)，就如同我(wo)們(men)買(mai)手機(ji)電(dian)腦(nao)不能單純看(kan)硬件配(pei)置，更要關(guan)註品(pin)牌型(xing)號壹(yi)樣(yang)。而對(dui)於(yu)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)，方(fang)法(fa)就是找壹(yi)下相關(guan)的文(wen)獻(xian)，看(kan)壹(yi)看(kan)實際(ji)的成像(xiang)圖(tu)效(xiao)果與(yu)對(dui)應(ying)的數(shu)據結(jie)果。

3. 軟(ruan)件功(gong)能：葉(ye)綠素(su)熒(ying)光參數(shu)及對(dui)應(ying)成像(xiang)圖(tu)、無人(ren)值(zhi)守(shou)自動(dong)測量、

1） PAM脈(mai)沖(chong)調制式葉綠素(su)熒(ying)光參數(shu)

    基(ji)於(yu)不(bu)同的實驗(yan)目(mu)的，我(wo)們(men)可以選(xuan)擇不同的Protocol獲(huo)取熒光(guang)參數(shu)及對(dui)應(ying)的成像(xiang)圖(tu)：

Fv/Fm：測量參數(shu)包括F₀，Fm，Fv，QYmax（Fv/Fm）等(deng)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光參數(shu)

Kautsky誘(you)導(dao)效(xiao)應(ying)：F₀，Fp，Fv，Ft_Lss，QY，Rfd等(deng)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光參數(shu)

Quenching熒(ying)光(guang)淬滅動(dong)力(li)學分(fen)析(xi)：F₀，Fm，Fp，Fs，Fv，F₀’，Fm’，QYmax（Fv/Fm），QY，NPQ，qN，qP，Rfd，qL等(deng)50多(duo)個葉綠素(su)熒(ying)光參數(shu)

Light Curve光(guang)響(xiang)應(ying)曲(qu)線：不(bu)同光(guang)強(qiang)梯(ti)度條(tiao)件下Fo，Fm，QY，QY_Ln，ETR等(deng)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光參數(shu)

在(zai)熒(ying)光淬滅(mie)動(dong)力(li)學測量時，還(hai)有(you)壹(yi)個難題(ti)，就(jiu)是如何(he)測量光適(shi)應(ying)條(tiao)件下的最小(xiao)熒(ying)光F₀’。由於(yu)這(zhe)光適(shi)應(ying)條(tiao)件下，難以讓(rang)測試(shi)樣(yang)品(pin)達到原(yuan)初狀態，就(jiu)沒(mei)辦(ban)法(fa)直(zhi)接(jie)測量F₀’。這(zhe)不是PAM技術本(ben)身可以解(jie)決的。因(yin)此(ci)，由於(yu)技術限(xian)制，很長壹(yi)段(duan)時間內葉(ye)綠素(su)熒(ying)光儀器(qi)都不能直(zhi)接(jie)測量F₀’。1997年(nian)，Oxborough和Baker提(ti)出(chu)了壹(yi)個F₀’的估算(suan)公式：

之(zhi)後的壹(yi)系(xi)列研(yan)究(jiu)證(zheng)明，這(zhe)個公式估算(suan)得到的數(shu)據是可信(xin)的。但(dan)這(zhe)個數(shu)據終究不是直(zhi)接(jie)測量得到的。在(zai)很多(duo)研(yan)究尤(you)其(qi)是光系(xi)統狀態轉(zhuan)換研(yan)究中，這(zhe)樣的數(shu)據是不能使(shi)用(yong)的。隨(sui)著(zhe)技術的進(jin)步(bu)，FluorCam通(tong)過(guo)配備專(zhuan)用(yong)的遠(yuan)紅(hong)光(guang)源板(ban)進行(xing)調制照射，使測量樣品(pin)達到原(yuan)初狀態，從而實現對(dui)F₀’進(jin)行(xing)實測。從另外(wai)壹(yi)個方面(mian)說(shuo)，沒(mei)有(you)配備(bei)遠(yuan)紅(hong)光(guang)源或(huo)者(zhe)是雖(sui)然有(you)遠(yuan)紅(hong)光(guang)，但(dan)不能對(dui)其(qi)進行(xing)調制測量的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光儀或(huo)者(zhe)熒光(guang)成像(xiang)儀(yi)都是不能實際(ji)測量F₀’的。

2） 自定義(yi)編(bian)輯protocol與(yu)參數(shu)

對(dui)於(yu)特定(ding)光合(he)作用(yong)機(ji)制的深(shen)入(ru)研(yan)究(jiu)，壹(yi)般(ban)常(chang)用(yong)的測量Protocol可能就(jiu)無法(fa)滿足需要了。比如中(zhong)科院(yuan)植物所(suo)光(guang)合(he)作用(yong)研(yan)究(jiu)中心(xin)、河(he)南(nan)大(da)學(xue)和瑞(rui)士日內(nei)瓦大(da)學(xue)合(he)作，研(yan)究(jiu)擬(ni)南(nan)芥(jie)內(nei)腔硫(liu)醇(chun)氧化(hua)還原(yuan)酶LOT1與(yu)絲氨(an)酸/蘇氨(an)酸蛋(dan)白(bai)激酶的功(gong)能性(xing)氧化(hua)還原(yuan)鏈接(jie)。光(guang)合(he)有機(ji)體(ti)為(wei)了(le)應(ying)對(dui)光強和光(guang)質(zhi)變化(hua)，需要(yao)進行(xing)狀態轉(zhuan)換來(lai)優(you)化(hua)光合(he)產額(e)並(bing)減(jian)輕(qing)光(guang)損(sun)傷(shang)。而這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)與之密(mi)切相(xiang)關(guan)。因此(ci)通過(guo)光合(he)系(xi)統狀態轉(zhuan)換過(guo)程(cheng)中葉綠素(su)熒(ying)光的動(dong)態(tai)變化(hua)是研究(jiu)這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)的最佳方(fang)法(fa)。

本(ben)研(yan)究通過(guo)FluorCam自定義(yi)編(bian)輯protocol功(gong)能，實現了(le)光(guang)合(he)狀態轉(zhuan)換的光(guang)照(zhao)模(mo)擬(ni)與(yu)熒光(guang)動(dong)力(li)學曲(qu)線檢測（上(shang)圖(tu)A、B），同時(shi)自動(dong)計(ji)算(suan)了狀態轉(zhuan)換參數(shu)qST（上(shang)圖(tu)D）並(bing)生(sheng)成了相(xiang)應(ying)成像(xiang)圖(tu)（上(shang)圖(tu)C），並(bing)與(yu)最大(da)光(guang)化(hua)學效(xiao)率Fv/Fm進(jin)行(xing)了(le)對(dui)比（上(shang)圖(tu)F），為(wei)本(ben)次研(yan)究(jiu)提供了極為重要的數(shu)據證(zheng)明。

3） 熒(ying)光(guang)成像(xiang)圖(tu)模(mo)式

FluorCam軟(ruan)件可提(ti)供(gong)不同的成像(xiang)數(shu)據處理(li)模(mo)式以供(gong)用戶獲(huo)得實驗(yan)需(xu)求(qiu)的彩(cai)色成像(xiang)圖(tu)：

n 基(ji)於(yu)每(mei)個像(xiang)素(su)的數(shu)據生(sheng)成成像(xiang)圖(tu)：這(zhe)種(zhong)模(mo)式能夠(gou)非常(chang)直(zhi)觀(guan)的顯(xian)示植物不(bu)同部(bu)位(wei)的熒(ying)光(guang)差(cha)異，模(mo)式。如下左圖(tu)。

n 基(ji)於(yu)每(mei)個樣品(pin)的平(ping)均(jun)數(shu)據生(sheng)成成像(xiang)圖(tu)：這(zhe)種(zhong)模(mo)式下，每個樣品(pin)以其(qi)平(ping)均(jun)數(shu)據只顯(xian)示壹(yi)種(zhong)顏(yan)色，而不顯(xian)示其(qi)內部(bu)差(cha)異。這(zhe)種(zhong)模(mo)式非常(chang)適用(yong)於(yu)大(da)量樣品(pin)的快(kuai)速(su)篩選。如下中圖(tu)和下右圖(tu)。

FluorCam軟(ruan)件還(hai)可以按不(bu)同的彩(cai)色標尺生成不同顏(yan)色範圍的成像(xiang)圖(tu)：

n 全(quan)光(guang)譜彩(cai)色標尺：紅(hong)色(se)-綠色(se)-藍(lan)色-黑(hei)色(se)的包(bao)含(han)全(quan)部(bu)可見(jian)光(guang)色彩(cai)。這(zhe)是對(dui)比度(du)最好(hao)也是發表(biao)文(wen)獻標尺。

n 多(duo)種(zhong)內置彩(cai)色標尺：如紅(hong)藍(lan)、紅(hong)黃藍(lan)、白藍(lan)、白黑(hei)等(deng)不同標尺，根據實際(ji)需(xu)要(yao)選(xuan)配。如白(bai)黑(hei)灰(hui)度(du)標尺可以非(fei)常直(zhi)觀(guan)地(di)顯(xian)示發出(chu)熒光(guang)的部(bu)位(wei)。

n 自定義(yi)標尺：軟件允(yun)許(xu)用戶(hu)自己設(she)置不同的標尺。比如綠黑(hei)標尺，可以模(mo)擬(ni)顯(xian)示GFP綠色(se)熒(ying)光的實際(ji)激(ji)發熒(ying)光(guang)圖。

4） 無人(ren)值(zhi)守(shou)自動(dong)測量

在(zai)脅迫等實驗(yan)處理(li)後，植物樣(yang)品(pin)會隨時間(jian)逐漸(jian)變化(hua)。如果用(yong)人(ren)工來(lai)測量這(zhe)壹(yi)動(dong)態(tai)變化(hua)過程(cheng)的話(hua)，對(dui)人(ren)力損(sun)耗很大(da)，時(shi)間上(shang)也(ye)難(nan)以精確。FluorCam提(ti)供(gong)無人(ren)值(zhi)守(shou)自動(dong)測量功(gong)能則(ze)可以讓(rang)研(yan)究(jiu)者很輕松地(di)進行(xing)這(zhe)壹(yi)類(lei)實驗(yan)。 

5） 圖(tu)像(xiang)定(ding)量分(fen)級（閾(yu)值(zhi)分(fen)割）

植物樣(yang)品(pin)在實驗(yan)處理(li)後，不同部(bu)位(wei)的受(shou)損(sun)程(cheng)度不同。FluorCam軟(ruan)件提(ti)供(gong)閾(yu)值(zhi)分(fen)割的方(fang)法(fa)來(lai)將成像(xiang)圖(tu)進(jin)行(xing)定(ding)量分(fen)級。比如將(jiang)受(shou)脅迫的葉(ye)片按葉(ye)綠素(su)熒(ying)光參數(shu)（如Fv/Fm）分(fen)為受(shou)損(sun)部(bu)位和健(jian)康(kang)部位(wei)，受損(sun)部(bu)位再進壹(yi)步(bu)分(fen)為嚴重受損(sun)、中(zhong)度受損(sun)和輕(qing)度(du)受損(sun)。軟(ruan)件可以輸(shu)出(chu)每種(zhong)級別(bie)的成像(xiang)圖(tu)、平(ping)均(jun)熒(ying)光數(shu)據和實際(ji)面(mian)積(ji)。 

4. 擴(kuo)展(zhan)成像(xiang)功(gong)能

如果壹(yi)臺(tai)葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)還(hai)能進(jin)行(xing)其(qi)他成像(xiang)測量，壹(yi)臺(tai)儀器(qi)能當(dang)多(duo)臺(tai)用，那(na)不(bu)是大(da)賺(zhuan)了嗎？那麽(me)讓(rang)我(wo)們(men)看壹(yi)下，以現在(zai)的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術而言(yan)，我(wo)們(men)還能擴(kuo)展(zhan)哪些(xie)成像(xiang)測量功(gong)能。

1） PAR吸(xi)收(shou)率成像(xiang)

我(wo)們(men)都知(zhi)道(dao)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光參數(shu)電子傳(chuan)遞(di)速率(lv)ETR=Φ_psII×PAR×0.5×leaf PAR absorptivity。壹(yi)般(ban)的公式中會默(mo)認(ren)植物光(guang)合(he)有效(xiao)輻射吸(xi)收(shou)率（PAR absorptivity）為(wei)0.84。但(dan)這(zhe)僅(jin)僅(jin)是壹(yi)個經驗(yan)數(shu)據。對(dui)於(yu)不(bu)同植物、植物的不(bu)同部(bu)位(wei)、不同生(sheng)理(li)狀態和生(sheng)長(chang)階段，其(qi)吸(xi)收(shou)率都是不同的。因(yin)此(ci)在(zai)實際(ji)應(ying)用(yong)中，光合(he)有效(xiao)輻射吸(xi)收(shou)率應(ying)該(gai)進行(xing)實測。光(guang)合(he)有效(xiao)輻射吸(xi)收(shou)率的實測是應(ying)用(yong)了植物反(fan)射(she)光(guang)譜的原(yuan)理(li)。植物對(dui)紅(hong)光(guang)是高(gao)吸(xi)收(shou)的，而對(dui)於(yu)近(jin)紅(hong)外(wai)光則(ze)是高(gao)反(fan)射(she)的。因(yin)此(ci)，通(tong)過(guo)紅(hong)色(se)光(guang)源與紅(hong)外(wai)光源照射(she)植物樣(yang)品(pin)，測量植物樣(yang)品(pin)對(dui)每種(zhong)光源的反(fan)射(she)率(lv)，根據公式計(ji)算(suan)得出(chu)光合(he)有效(xiao)輻射吸(xi)收(shou)率。其(qi)計(ji)算(suan)公式為：

FluorCam通(tong)過(guo)配備專(zhuan)用(yong)的紅(hong)色(se)與(yu)紅(hong)外(wai)光源板(ban)、相應(ying)的濾(lv)波輪(lun)和濾(lv)波片實現了(le)對(dui)PAR吸(xi)收(shou)率以及NDVI植被歸壹(yi)化(hua)指數(shu)的成像(xiang)，不(bu)但(dan)使ETR的計(ji)算(suan)結(jie)果更(geng)加真實可信(xin)，而且PAR吸(xi)收(shou)率和NDVI的變化(hua)也可以直(zhi)接(jie)反(fan)應(ying)植物結(jie)構(gou)生理(li)和葉(ye)綠素(su)含(han)量的改(gai)變等。

2） GFP、YFP、RFP、DAPI等(deng)熒(ying)光蛋白(bai)或(huo)熒(ying)光染(ran)料成像(xiang)

在(zai)進(jin)行(xing)轉(zhuan)基因(yin)植物研(yan)究(jiu)時，經常需(xu)要(yao)用到GFP等(deng)各(ge)種(zhong)熒光(guang)蛋(dan)白或(huo)熒(ying)光染(ran)料。以前(qian)在(zai)鑒(jian)定(ding)這(zhe)些(xie)熒光(guang)蛋白表達時(shi)壹(yi)般(ban)都是使用(yong)熒(ying)光顯(xian)微鏡對(dui)每壹(yi)個樣品(pin)逐壹(yi)篩查，工作(zuo)量很大(da)。FluorCam由於(yu)能夠(gou)配備(bei)多(duo)種(zhong)不同波段(duan)的激(ji)發光(guang)源和相(xiang)應(ying)濾(lv)波片，具備了(le)對(dui)熒光蛋白的高(gao)通量宏觀(guan)篩查的能力(li)。同時(shi)由於(yu)其(qi)具備的熒(ying)光(guang)定(ding)量分(fen)析(xi)功(gong)能，還(hai)能對(dui)熒光蛋白的表(biao)達進(jin)行(xing)相(xiang)對(dui)定量分(fen)析(xi)。 

3） UV-MCF紫(zi)外(wai)激發多(duo)光(guang)譜熒光成像(xiang)

二(er)十(shi)世(shi)紀八(ba)九(jiu)十(shi)年代，植物生(sheng)理(li)學(xue)家(jia)和園藝學家(jia)對(dui)植物活體(ti)熒(ying)光(guang)——主要(yao)是葉綠素(su)熒(ying)光研究(jiu)不(bu)斷深入(ru)。當(dang)科學家(jia)使用(yong)UV紫(zi)外(wai)光對(dui)植物葉(ye)片進行(xing)激(ji)發，發現植物產生(sheng)了具備4個特征(zheng)性(xing)波峰(feng)的熒(ying)光(guang)光(guang)譜。這(zhe)4個特征(zheng)性(xing)波峰(feng)的波長(chang)分(fen)別(bie)為藍(lan)光440nm（F440）、綠光(guang)520nm（F520）、紅(hong)光(guang)690nm（F690）和遠(yuan)紅(hong)外(wai)光740nm（F740）。這(zhe)個特征(zheng)激發熒(ying)光(guang)光譜就稱為(wei)多(duo)光(guang)譜熒光（Multi-color Fluorescence）。

進(jin)壹(yi)步(bu)的研(yan)究(jiu)發現，多(duo)光(guang)譜熒光與(yu)植物次生(sheng)代(dai)謝總(zong)體(ti)水(shui)平(ping)、葉(ye)綠素(su)濃(nong)度、脅迫早(zao)期指示(shi)等(deng)密(mi)切相(xiang)關(guan)（Pineda, 2008），尤(you)其(qi)在各(ge)種(zhong)脅迫因素(su)的早(zao)期識別(bie)與抗(kang)性(xing)評估中表(biao)現極為靈(ling)敏。

在(zai)最近十(shi)年間，西班(ban)牙(ya)國(guo)家(jia)研究(jiu)委員(yuan)會（CSIC）已(yi)經利(li)用FluorCam多(duo)光(guang)譜熒光成像(xiang)技術結(jie)合(he)FluorCam葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術、熱成像(xiang)技術，對(dui)多(duo)種(zhong)蔬菜、水果的病(bing)害(hai)、養(yang)分(fen)、氣候(hou)變化(hua)適應(ying)等(deng)開(kai)展(zhan)了大(da)量的研(yan)究(jiu)。 

4） 雙(shuang)調制式葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)

如前(qian)文(wen)所(suo)說(shuo)，PAM熒(ying)光(guang)淬滅動(dong)力(li)學曲(qu)線、OJIP快(kuai)速(su)熒(ying)光(guang)動(dong)力(li)學曲(qu)線和QA-再(zai)氧(yang)化(hua)動(dong)力(li)學曲(qu)線分(fen)析(xi)是葉綠素(su)熒(ying)光技術的三(san)大(da)主要(yao)測量技術路(lu)線，分(fen)別(bie)對(dui)應(ying)光(guang)系(xi)統運(yun)行(xing)機(ji)理(li)的不(bu)同方(fang)面(mian)。與PAM熒(ying)光(guang)淬滅分(fen)析(xi)主要(yao)針(zhen)對(dui)光系(xi)統運(yun)行(xing)中(zhong)較(jiao)慢的光(guang)合(he)穩態(tai)與(yu)熒(ying)光淬(cui)滅(mie)不同，OJIP快(kuai)速(su)熒(ying)光(guang)動(dong)力(li)學曲(qu)線和QA-再(zai)氧(yang)化(hua)動(dong)力(li)學曲(qu)線分(fen)析(xi)都需要(yao)非常(chang)高(gao)的檢測速(su)度。

OJIP快(kuai)速(su)熒(ying)光(guang)動(dong)力(li)學曲(qu)線測量要求(qiu)對(dui)樣品(pin)經過暗(an)適應(ying)後的最小(xiao)熒(ying)光上(shang)升(sheng)到最大(da)熒(ying)光這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)進行(xing)快(kuai)速(su)檢測。QA-再(zai)氧(yang)化(hua)動(dong)力(li)學曲(qu)線測量是運用(yong)STF（single turnover flash，單周轉(zhuan)光閃(shan)）測量光系(xi)統II中(zhong)QA再(zai)氧(yang)化(hua)過程(cheng)中熒光產額(e)的衰減(jian)曲(qu)線，從而衡(heng)量QA傳(chuan)輸電(dian)子的能力(li)。

這(zhe)兩(liang)種(zhong)動(dong)力(li)學分(fen)析(xi)在葉綠素(su)熒(ying)光儀上(shang)是相對(dui)比較(jiao)容(rong)易(yi)實現的。FL6000雙(shuang)調制葉綠素(su)熒(ying)光儀就(jiu)可以同時(shi)實現這(zhe)三(san)類動(dong)力(li)學分(fen)析(xi)。但(dan)由於(yu)成像(xiang)CCD元(yuan)件的成像(xiang)速(su)度(du)限(xian)制，壹(yi)般(ban)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)根(gen)本無法(fa)達到。國(guo)際(ji)上(shang)僅(jin)有FluorCam的兩(liang)個型號——FluorCam封(feng)閉(bi)式熒光(guang)成像(xiang)系(xi)統和FKM多(duo)光(guang)譜熒光動(dong)態(tai)顯(xian)微成像(xiang)系(xi)統通(tong)過(guo)泵浦成像(xiang)技術分(fen)別(bie)實現了(le)葉(ye)片層次與(yu)細(xi)胞(bao)層(ceng)次的OJIP和QA-再(zai)氧(yang)化(hua)動(dong)力(li)學曲(qu)線的擬(ni)合(he)成像(xiang)測量並(bing)得(de)到國(guo)際(ji)學(xue)界(jie)的認(ren)可。

2019年(nian)，捷(jie)克(ke)科學院(yuan)Küpper教授(shou)與(yu)PSI公司(si)合(he)作，將(jiang)超(chao)高(gao)靈(ling)敏度成像(xiang)傳(chuan)感(gan)器(qi)與(yu)葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術結(jie)合(he)，實現了(le)在(zai)640×512圖(tu)像(xiang)分(fen)辨率(lv)下高(gao)達4000幀/秒的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)速(su)度(du)。這(zhe)壹(yi)技術實現了(le)真(zhen)正的OJIP快(kuai)速(su)熒(ying)光(guang)誘導動(dong)力(li)學曲(qu)線和QA-再(zai)氧(yang)化(hua)動(dong)力(li)學曲(qu)線成像(xiang)測量

5） FKM多(duo)光(guang)譜熒光動(dong)態(tai)顯(xian)微成像(xiang)

目(mu)前(qian)主要(yao)的葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)儀(yi)器(qi)都是針(zhen)對(dui)宏觀(guan)樣品(pin)進行(xing)測量的。但(dan)很多(duo)研(yan)究中(zhong)希(xi)望(wang)能夠(gou)對(dui)單個微藻、大(da)型(xing)藻或(huo)植物細(xi)胞(bao)乃(nai)至單個葉綠體(ti)直(zhi)接(jie)進(jin)行(xing)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)測量，從細(xi)胞(bao)微觀(guan)尺度對(dui)光合(he)作用(yong)進(jin)行(xing)研(yan)究(jiu)。於(yu)是，將FluorCam熒(ying)光(guang)成像(xiang)技術與(yu)生物(wu)熒光顯(xian)微成像(xiang)技術有(you)機結(jie)合(he)的FKM多(duo)光(guang)譜熒光動(dong)態(tai)顯(xian)微成像(xiang)技術便(bian)應(ying)運(yun)而生。 

FKM技術在(zai)藻類(lei)方面的壹(yi)個突出(chu)研究(jiu)成果是對(dui)藍(lan)藻異形胞(bao)的持(chi)續研究，弄(nong)清(qing)了(le)異形胞(bao)分(fen)化(hua)過程(cheng)中光合(he)特性(xing)的變化(hua)以及與藍(lan)藻固(gu)氮(dan)的相(xiang)互(hu)關(guan)系(xi)，乃至(zhi)助(zhu)力(li)培育高(gao)固氮(dan)能力(li)的藍(lan)藻新品(pin)種(zhong)。 

在(zai)高(gao)等植物方(fang)面(mian)，FKM技術則(ze)廣(guang)泛應(ying)用(yong)於(yu)各(ge)種(zhong)特殊(shu)的微觀(guan)光合(he)結(jie)構(gou)的功(gong)能研(yan)究(jiu)，如秋(qiu)海(hai)棠(tang)藍(lan)色葉(ye)片中的特殊(shu)質體(ti)、玉(yu)米(mi)葉(ye)片“花環"結(jie)構(gou)等。

三(san)、 FluorCam 1300植物葉(ye)綠素(su)熒(ying)光與多(duo)光(guang)譜熒光成像(xiang)系(xi)統

時(shi)至(zhi)今(jin)日(ri)，葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術依然在(zai)不(bu)斷更(geng)新升級。最後，我(wo)們(men)簡單介(jie)紹壹(yi)下FluorCam系(xi)列的成果。

FluorCam 1300植物葉(ye)綠素(su)熒(ying)光與多(duo)光(guang)譜熒光成像(xiang)系(xi)統是FluorCam葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)技術的最新升級產品(pin)。無需(xu)更(geng)換(huan)配件即(ji)可實現PAM脈(mai)沖(chong)調制式葉綠素(su)熒(ying)光、UV-MCF紫(zi)外(wai)激發多(duo)光(guang)譜熒光和GFP、RFP、YFP等(deng)熒(ying)光蛋白(bai)和熒(ying)光(guang)染料的成像(xiang)分(fen)析(xi)。測量對(dui)象(xiang)包(bao)括葉(ye)片、果實、花朵、麥(mai)穗、整株(zhu)小(xiao)型(xing)植株(zhu)、苔蘚(xian)、微藻、大(da)型(xing)藻類乃至(zhi)特定(ding)的動(dong)物(wu)樣品(pin)。

功(gong)能特點(dian)：

n FluorCam 1300同時(shi)具備葉(ye)綠素(su)熒(ying)光激發光(guang)源組、多(duo)光(guang)譜熒光激(ji)發光(guang)源組和熒(ying)光(guang)濾(lv)波器(qi)組(zu)，無需(xu)更(geng)換(huan)任何(he)配(pei)件即(ji)可同步(bu)實現多(duo)激(ji)發光(guang)-多(duo)光(guang)譜熒光成像(xiang)功(gong)能：

Ÿ PAM脈(mai)沖(chong)調制式葉綠素(su)熒(ying)光成像(xiang)

Ÿ 紫(zi)外(wai)激發F440、F520、F690、F740多(duo)光(guang)譜熒光成像(xiang)

Ÿ GFP、RFP、YFP等(deng)常(chang)用熒光(guang)蛋(dan)白成像(xiang)

n 壹(yi)體(ti)式設(she)計(ji)，自帶(dai)暗(an)適應(ying)箱體(ti)

n 最佳成像(xiang)面(mian)積(ji)：20×20cm

n 葉(ye)綠素(su)熒(ying)光激發光(guang)源組：

Ÿ 測量光：620nm紅(hong)光(guang)

Ÿ 光(guang)化(hua)學光(guang)：620nm紅(hong)光(guang)、5700K冷(leng)白(bai)光，最大(da)光(guang)強1500µmol(photons)/m².s

Ÿ 飽(bao)和脈(mai)沖(chong)光(guang)：5700K冷(leng)白(bai)光，最大(da)光(guang)強5000µmol(photons)/m².s

Ÿ 735nm遠(yuan)紅(hong)光(guang)，用(yong)於(yu)測量光適(shi)應(ying)條(tiao)件下的最小(xiao)熒(ying)光F₀’

n 多(duo)光(guang)譜熒光激(ji)發光(guang)源組（選(xuan)配(pei)）：6色(se)集成光源，每個光源同時(shi)具備6種(zhong)不同波長(chang)的光(guang)發射(she)能力(li)，包(bao)括365nm紫(zi)外(wai)光，445nm品(pin)藍(lan)光，470nm藍(lan)光，505nm青(qing)光(guang)，530nm綠光(guang)，590nm琥珀(po)色光(guang)

實測成像(xiang)圖(tu)：不(bu)同顏(yan)色淩(ling)霄(xiao)葉片的熒(ying)光(guang)成像(xiang)分(fen)析(xi)