MC1000 8 通道(dao)藻類培(pei)養(yang)與在(zai)線監(jian)測系統(tong)應用案(an)例(li)

MC1000 8通道(dao)藻(zao)類培(pei)養(yang)與在(zai)線監(jian)測系統(tong)，是(shi)由(you)8個100ml藻類培(pei)養(yang)試管、水(shui)浴控(kong)溫系統(tong)、多(duo)色LEDs光源控(kong)制(zhi)系統(tong)及光密(mi)度和溶(rong)解氧（選配(pei)）在(zai)線監(jian)測系統(tong)等(deng)組(zu)成(cheng)的專業(ye)藻(zao)類培(pei)養(yang)設(she)備，可(ke)用於(yu)藻(zao)類培(pei)養(yang)與控制(zhi)實驗、梯度對(dui)比實驗等(deng)，適(shi)於碳(tan)同化(hua)研(yan)究(jiu)、水(shui)體生態毒理(li)學(xue)研(yan)究(jiu)檢測、藻類生理生態研(yan)究(jiu)、水(shui)生態研(yan)究(jiu)等(deng)。

案例(li)壹：通(tong)過遺傳(chuan)和環境(jing)協(xie)同(tong)擾(rao)動(dong)手(shou)段(duan)獲(huo)得耐(nai)高(gao)溫高(gao)光藍藻突(tu)變(bian)體(ti)

光合作(zuo)用是(shi)地(di)球上最重要的生化過(guo)程(cheng)之壹(yi)，但(dan)高(gao)光和高(gao)溫（HLHT）脅迫(po)會損(sun)害光合作(zuo)用的效(xiao)率(lv)。提(ti)高(gao)光自養(yang)生物對(dui)HLHT的耐(nai)受(shou)性(xing)對(dui)於農業(ye)和其他依(yi)賴光合作(zuo)用的經濟(ji)活動至關重要。然而(er)目前獲(huo)得耐(nai)HLHT光自養(yang)生物費(fei)時費(fei)力，其潛(qian)在(zai)的分子(zi)機(ji)制(zhi)也暫(zan)不明(ming)確。

在(zai)中(zhong)國(guo)科(ke)學(xue)院青島(dao)生物能源與(yu)過程(cheng)研(yan)究(jiu)所的壹項(xiang)研(yan)究(jiu)中(zhong)，開(kai)發了(le)壹(yi)套(tao)高(gao)突(tu)變(bian)系統(tong)，通過基(ji)因遺傳(chuan)保真(zhen)元(yuan)件敲(qiao)除、誘變(bian)元(yuan)件表達的策略(lve)，結(jie)合(he)高(gao)溫高(gao)光培養(yang)，將(jiang)藍(lan)藻(zao)的突(tu)變(bian)率(lv)提(ti)高(gao)了三(san)個數量(liang)級(ji)。利用這(zhe)個高(gao)突(tu)變(bian)系統(tong)，研(yan)究(jiu)人員快速(su)獲(huo)得(de)了(le)HLHT耐(nai)受(shou)能力顯著(zhu)提(ti)高(gao)的突(tu)變(bian)藻株，並揭(jie)示了影(ying)響(xiang)藍(lan)藻HLHT耐(nai)受(shou)能力的關鍵(jian)靶點與功(gong)能機(ji)制(zhi)。

其(qi)中(zhong)，高(gao)突(tu)變(bian)系統(tong)的高(gao)溫高(gao)光環境(jing)，即(ji)為(wei)MC1000多(duo)通(tong)道(dao)藻(zao)類培(pei)養(yang)與在(zai)線監(jian)測系統(tong)提供(gong)，研(yan)究(jiu)中(zhong)使用MC1000設(she)置(zhi)不(bu)同(tong)的溫度(du)光強條(tiao)件(jian)給(gei)聚(ju)球(qiu)藻(zao)施(shi)加(jia)環境(jing)壓(ya)力，觸(chu)發聚球(qiu)藻(zao)高(gao)突(tu)變(bian)狀(zhuang)態(tai)。另(ling)外，藻的預培(pei)養、相對(dui)突(tu)變(bian)率(lv)評估(gu)、分離(li)出的突(tu)變(bian)藻(zao)株培(pei)養、耐(nai)高(gao)溫高(gao)光評估(gu)等(deng)，也(ye)均(jun)在(zai)MC1000中(zhong)設(she)定相應培養(yang)條(tiao)件(jian)進(jin)行(xing)。易科(ke)泰(tai)為(wei)中(zhong)科(ke)院能源所提(ti)供(gong)了(le)多(duo)套(tao)不(bu)同(tong)配置(zhi)的MC1000，這(zhe)些(xie)設(she)備也(ye)在(zai)為(wei)研(yan)究(jiu)人員的多(duo)種實驗不斷(duan)工(gong)作(zuo)著。

案(an)例(li)二(er)：輻(fu)照度和無機(ji)碳(tan)利用率(lv)對(dui)長柄聚球(qiu)菌(jun)PCC 7942異源蔗糖(tang)產(chan)量(liang)的影(ying)響(xiang)

蔗糖(tang)是(shi)生物乙醇的重要(yao)原料(liao)，也(ye)是(shi)許多(duo)高(gao)附加(jia)值(zhi)化學(xue)品的有(you)前景(jing)的基(ji)石。植物是(shi)蔗(zhe)糖(tang)的主要(yao)來源(yuan)，但(dan)由(you)於(yu)耕(geng)地(di)和水(shui)資源(yuan)利用倫(lun)理(li)問題等(deng)原(yuan)因，尋找另壹種蔗糖(tang)來(lai)源以替(ti)代植物十(shi)分必要。藍(lan)藻(zao)細菌(jun)已(yi)被認(ren)為(wei)是(shi)壹(yi)種潛(qian)在(zai)的碳水(shui)化合(he)物原料，多(duo)種物種已(yi)被成(cheng)功(gong)地(di)設(she)計為(wei)分泌蔗(zhe)糖(tang)，但(dan)不同(tong)模(mo)式(shi)物種之間，蔗(zhe)糖(tang)生產力存在(zai)相當(dang)大的差異(yi)。本(ben)研(yan)究(jiu)案例(li)中(zhong)，對(dui)不(bu)同(tong)的實驗室設(she)備和生長條件（特別(bie)是(shi)光照、CO2和培養(yang)器(qi)類型(xing)）如何(he)影(ying)響(xiang)藍藻的蔗(zhe)糖(tang)生產進(jin)行(xing)了(le)系統(tong)的評估(gu)。

其(qi)中(zhong)，便(bian)利用MC1000進(jin)行(xing)了(le)藍(lan)藻(zao)光耐(nai)受(shou)性(xing)和蔗糖(tang)生產力評估(gu)，所使用的藍藻(zao)為(wei)蔗糖(tang)滲透(tou)酶(mei) (cscB)和蔗糖(tang)磷(lin)酸合酶(mei)（sps）表達的特定(ding)藻株S. elongatus。實驗中(zhong)，將(jiang)培(pei)養(yang)溫(wen)度(du)設(she)定為(wei)32℃，通3％CO2氣(qi)體，分(fen)別(bie)用150,250,500,1000,2000μmol/m2/s光強（冷(leng)白光）培養(yang)，在(zai)0,24h,48h,72h分別(bie)檢測藻液的OD750及蔗(zhe)糖(tang)含量(liang)。

結(jie)果(guo)可(ke)知(zhi)，野生型(xing)（WT）和不生產蔗(zhe)糖(tang)的藻株（non-exporting cscB/sps）OD750在(zai)幾個光強下(xia)均(jun)可以達(da)到2.2，而S. elongatus的OD750則較低(di)，這(zhe)是(shi)因為(wei)它將(jiang)固(gu)定的碳更(geng)多(duo)的用來(lai)生產蔗(zhe)糖(tang)，導(dao)致(zhi)其(qi)細(xi)胞生長受(shou)限，生物量(liang)下降。用於(yu)藍(lan)藻(zao)培養的輻(fu)照度與(yu)蔗(zhe)糖(tang)生產力之間存(cun)在(zai)直(zhi)接(jie)關系，500μmol/m2/s時達到最大，而(er)當光強超過這(zhe)個閾值(zhi)，其蔗(zhe)糖(tang)產(chan)量(liang)則開(kai)始(shi)下(xia)降(jiang)。

但在(zai)進(jin)壹(yi)步的實驗中(zhong)，將(jiang)藻(zao)株的初始(shi)接(jie)種濃度(du)提高(gao)，使用2000及(ji)2500μmol/m2/s光強培(pei)養(yang)，其蔗糖(tang)產(chan)量(liang)則有(you)所上升，高(gao)光強度(du)被(bei)S. elongatus耐(nai)受(shou)，特別(bie)是(shi)在(zai)高(gao)密(mi)度培(pei)養下，可(ke)能是(shi)其(qi)濁(zhuo)度(du)減(jian)弱了培(pei)養物中(zhong)透(tou)過(guo)的有(you)效(xiao)光照。正是(shi)MC1000高(gao)光強、多(duo)通(tong)道(dao)的配置(zhi)為(wei)實驗提供了(le)培養(yang)和檢測條件(jian)。

案(an)例(li)二(er)：碳(tan)通量(liang)調節(jie)蛋(dan)白pirC對(dui)工程(cheng)藍藻(zao)乙醇生產的影(ying)響(xiang)

由於人(ren)類活(huo)動(dong)導致(zhi)的大氣(qi)中(zhong)CO2濃(nong)度(du)上升是(shi)全(quan)球氣(qi)候(hou)變(bian)化(hua)的主要(yao)因素(su)之壹(yi)。為(wei)了減(jian)少對(dui)化石碳源(yuan)的依(yi)賴，需要尋找可持(chi)續的CO2利用過(guo)程(cheng)，如利用光合自(zi)養(yang)微(wei)生物（例(li)如藍(lan)藻(zao)）碳(tan)同化途(tu)徑(jing)進(jin)行(xing)生物質的生成(cheng)。藍(lan)藻作(zuo)為(wei)可持(chi)續生物經濟(ji)的有(you)前景(jing)的工程(cheng)底盤(pan)，但目前菌(jun)株通(tong)常生產力較低(di)，工業(ye)應用受(shou)限。通(tong)過基(ji)因工程(cheng)改造藍細菌(jun)，可(ke)以(yi)提高(gao)其生產乙(yi)醇等(deng)有(you)價值(zhi)產品的效(xiao)率(lv)，從而為(wei)可持(chi)續能源生產提(ti)供新(xin)的可能性(xing)。

本(ben)研(yan)究(jiu)案例(li)使用了(le)改造後(hou)的藍藻(zao)Synechocystis sp. PCC 6803，該(gai)藍藻(zao)通過表達來自(zi)Zymomonas mobilis的丙酮酸脫羧(suo)酶（PDC）和來自(zi)Synechocystis sp. PCC 6803的乙醇(chun)脫氫酶(mei)（ADH）來產(chan)生乙醇(chun)。通(tong)過(guo)敲(qiao)除調節(jie)蛋(dan)白pirC的基(ji)因，在(zai)不同的氮或碳(tan)條(tiao)件下培(pei)養藻株，並(bing)分析乙(yi)醇(chun)產量(liang)，研(yan)究(jiu)pirC對(dui)乙醇(chun)產量(liang)的影(ying)響(xiang)。

乙醇生產實驗在(zai)MC1000中(zhong)進(jin)行(xing)，培(pei)養(yang)過(guo)程(cheng)中(zhong)使用MC1000連續自動(dong)測量(liang)720nm光密(mi)度（OD720），並在(zai)第0、3、5和7天(tian)采樣(yang)手(shou)動測定OD720。培養過(guo)程(cheng)中(zhong)，排(pai)出的氣(qi)體流入(ru)收(shou)集瓶(ping)，量(liang)化了培養容(rong)器(qi)造(zao)成(cheng)的揮發(fa)性(xing)乙(yi)醇(chun)的損(sun)失。在(zai)培養物的第3、5、7天(tian)提取乙(yi)醇(chun)定量(liang)樣(yang)品。第7天進(jin)行(xing)代(dai)謝(xie)物定量(liang)。

結(jie)果(guo)發現，藻(zao)株生長速(su)率(lv)和乙醇(chun)產(chan)量(liang)之間存(cun)在(zai)明(ming)顯的相關性(xing)。經過(guo)之後(hou)更多(duo)實驗證(zheng)明(ming)，pirC的突(tu)變(bian)在(zai)氮耗竭條(tiao)件(jian)下對(dui)乙醇(chun)生產有(you)積(ji)極(ji)影(ying)響(xiang)。乙醇產(chan)量(liang)的增(zeng)加(jia)伴隨著丙酮酸水(shui)平的升高(gao)和糖(tang)原(yuan)水(shui)平的降低(di)，表明(ming)pirC的缺(que)失確實增(zeng)加(jia)了碳(tan)向(xiang)較低(di)糖(tang)酵(jiao)解途(tu)徑(jing)的分配(pei)。

參考(kao)文(wen)獻(xian)：

[1] Sun H, Luan G, Ma Y, et al. Engineered hypermutation adapts cyanobacterial photosynthesis to combined high light and high temperature stress[J]. Nature Communications, 2023, 14(1): 1238.

[2] Yun L, Zegarac R, Ducat D C. Impact of irradiance and inorganic carbon availability on heterologous sucrose production in Synechococcus elongatus PCC 7942[J]. Frontiers in Plant Science, 2024, 15: 1378573.

[3] Böhm J, Kauss K, Michl K, et al. Impact of the carbon flux regulator protein pirC on ethanol production in engineered cyanobacteria[J]. Frontiers in Microbiology, 2023, 14: 1238737.

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