FluorCam 多(duo)光譜(pu)熒光成(cheng)像應(ying)用於(yu)分子(zi)生物學(xue)研究

FluorCam多光譜(pu)熒光成(cheng)像應(ying)用於(yu)分子(zi)生物學(xue)研究——

擬南(nan)芥基(ji)因敲除(chu)：對壹種(zhong)病(bing)毒(du)產(chan)生抗性(xing)，卻引(yin)發另壹種(zhong)病(bing)毒(du)易(yi)感？

馬鈴(ling)薯 Y 病(bing)毒(du)屬（Potyvirus），是壹類(lei)嚴(yan)重影響(xiang)植物(wu)生長(chang)生產(chan)的植物(wu)病(bing)毒(du)屬，有數百個(ge)種(zhong)，包括大(da)豆(dou)花(hua)葉(ye)病(bing)毒(du)（SMV）、三(san)葉(ye)草黃(huang)脈病(bing)毒(du)（CIYVV）、蕪(wu)菁(jing)花葉(ye)病(bing)毒(du)（TuMV）deng 等(deng)。植物(wu)中的翻(fan)譯起始因子4E是對馬鈴薯Y病(bing)毒(du)屬敏感的壹個(ge)小(xiao)家族(zu)。當(dang)作(zuo)物中編碼eIF4E蛋(dan)白(bai)的天(tian)然(ran)抗性等(deng)位基因缺失(shi)時，敲除(chu)這(zhe)些(xie)4E家族(zu)基(ji)因，可以(yi)賦(fu)予(yu)作(zuo)物遺傳抗性。eIF4E1是4E家族(zu)中(zhong)壹個(ge)對CIYVV敏感的翻(fan)譯起始因子，本研究探討了利用敲除(chu)eIF4E1對擬南(nan)芥的病(bing)毒(du)抗性的雙重影響(xiang).

研究結果(guo)表明(ming)，敲除(chu)eIF4E1後(hou)，對CIYVV敏感的植株對三(san)葉(ye)草黃(huang)脈病(bing)毒(du)（ClYVV）表現(xian)出(chu)抗性(xing)，但(dan)對蕪(wu)菁(jing)花葉(ye)病(bing)毒(du)（TuMV）的敏感性(xing)顯(xian)著(zhu)增(zeng)強。而通過(guo)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shu)構建(jian)功(gong)能(neng)抗(kang)性(xing)等(deng)位基因eIF4E1可避免對TuMV的超敏反(fan)應(ying)，同時保留對ClYVV的抗性(xing)。研究提(ti)示(shi)，基(ji)因敲除(chu)策(ce)略可(ke)能(neng)因病(bing)毒(du)利用其(qi)他(ta)同源因子而(er)存在風(feng)險(xian)，而模擬天(tian)然(ran)抗性等(deng)位基因是更(geng)安全(quan)有效的策略。

  FluorCam多光譜(pu)熒光成(cheng)像系統(tong)，除(chu)了具備葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成(cheng)像，可以(yi)檢測(ce)植物(wu)光合(he)活性(xing)以外，還具備多(duo)光譜(pu)熒光成(cheng)像功(gong)能(neng)，比(bi)如FPs熒光蛋(dan)白(bai)成(cheng)像、UV-MCF紫外激(ji)發多光譜(pu)熒光成(cheng)像等(deng)。在這項研究中(zhong)，FluorCam便承(cheng)擔(dan)了檢(jian)測(ce)在病(bing)毒(du)侵(qin)染下(xia)不同基因型(xing)擬南(nan)芥的衰(shuai)老、追蹤GFP標記(ji)病(bing)毒(du)分布(bu)及量(liang)化的雙重角色(se)。

n eIF4E1功(gong)能(neng)喪(sang)失(shi)與(yu)TuMV感染癥狀加(jia)重有關

使用帶(dai)GFP標記(ji)的TuMV（TuMV-GFP UK1）感染三(san)個(ge)基(ji)因型(xing)的擬南(nan)芥，分(fen)別(bie)為野(ye)生型(xing)WT；敲除(chu)eIF4E1對CIYVV具抗性(xing)的基因型(xing)（eif4e1^KO）；敲除(chu)eIFiso4E對TuMV具抗性(xing)的基因型(xing)（eifiso4e^KO）。使用FluorCam檢測(ce)感染14天(tian)、21天(tian)之(zhi)後(hou)擬南(nan)芥葉(ye)綠素(su)熒(ying)光變化（表征(zheng)葉(ye)片(pian)衰(shuai)老情況(kuang)）及(ji)GFP表達(da)情況(kuang)（即(ji)TuMV病(bing)毒(du)積累程(cheng)度）。從(cong)結果(guo)可知，eifiso4e^KO因其具備的病(bing)毒(du)抗性，而(er)無明(ming)顯的病(bing)毒(du)侵(qin)染，性狀(zhuang)和(he)葉(ye)綠素(su)熒(ying)光水平無(wu)明(ming)顯變化，而(er)eif4e1^KO的GFP信號更(geng)強，說明(ming)其病(bing)毒(du)積累更(geng)多，葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成(cheng)像結果(guo)也顯(xian)示(shi)，其(qi)感染癥狀比(bi)野(ye)生型(xing)更(geng)為明顯(xian)，表現(xian)為更(geng)嚴(yan)重早(zao)衰(shuai)（葉(ye)綠素(su)熒(ying)光下(xia)降(jiang)）、新(xin)葉(ye)發育停滯。

n 基因功(gong)能(neng)驗(yan)證：

Ø 恢復eIF4E1表達(da)後(hou)，植株對TuMV的敏感性(xing)和(he)病(bing)毒(du)積累量(liang)恢復至野(ye)生型(xing)水平

為了確(que)認(ren)eif4e1^KO對TuMV易(yi)感是否(fou)由eIF4E1缺失(shi)有關，通過(guo)構建(jian)了兩(liang)個(ge)互補系eif4e1KO;eIF4E1-1和(he)eif4e1KO;eIF4E1-2，在感染TuMV-GFP UK1後(hou)，於(yu)17天(tian)後(hou)，分析(xi)了它(ta)們(men)的表型(xing)。FluorCam成(cheng)像結果(guo)表明(ming)，eif4e1KO;eIF4E1-1和(he)eif4e1KO;eIF4E1-2的病(bing)毒(du)易(yi)感性(xing)表現(xian)恢復到了與(yu)野(ye)生型(xing)相似(si)水平，比(bi)eif4e1^KO具有更(geng)高的TuMV抗性(xing)，證明(ming)了eIF4E1的敲除(chu)缺(que)失(shi)是eif4e1^KO突(tu)變體(ti)易(yi)感性(xing)和(he)病(bing)毒(du)積累增(zeng)加(jia)的原(yuan)因。

Ø  CRISPR/Cas9基因編輯技術(shu)將eIF4E1轉化(hua)為抗性(xing)等(deng)位基因eIF4E1^N176K  

研究中(zhong)，模擬(ni)豌(wan)豆(dou)eIF4E等(deng)位基因中與(yu)抗馬(ma)鈴(ling)薯(shu)病(bing)毒(du)屬相關的自然(ran)突(tu)變基因，通過(guo)基因編輯的方法獲(huo)得(de)非(fei)轉(zhuan)基因的eIF4E1^N176K植株，侵(qin)染實驗(yan)的結果(guo)證明(ming)，該(gai)基(ji)因編輯株對TuMV無超敏反(fan)應(ying)，且保留對ClYVV的抗性(xing)。  

結合(he)研究中(zhong)的其他(ta)實(shi)驗(yan)結果(guo)，得出(chu)結論(lun)，敲除(chu)eIF4E1雖賦(fu)予(yu)植株ClYVV的抗性(xing)，但(dan)卻引(yin)發了對TuMV的過(guo)度敏感。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shu)模擬(ni)天(tian)然(ran)抗性等(deng)位基因是更(geng)優策略，既(ji)可(ke)維(wei)持(chi)抗性，又避免對其他病(bing)毒(du)的易(yi)感性(xing)。研究強調基因敲除(chu)抗(kang)性(xing)育種(zhong)存在潛在風(feng)險(xian)，而功(gong)能(neng)性(xing)等(deng)位基因編輯更(geng)具應(ying)用前(qian)景(jing)。

n FluorCam多光譜(pu)熒光成(cheng)像助力(li)葉(ye)片(pian)衰(shuai)老和(he)病(bing)毒(du)感染程度檢(jian)測

作(zuo)為研究中(zhong)的主要(yao)檢測手(shou)段，FluorCam提供(gong)了多(duo)方(fang)面的數據(ju)支撐。葉(ye)綠素(su)熒(ying)光成(cheng)像結果(guo)體(ti)現(xian)了葉(ye)綠素(su)熒(ying)光強度變化量(liang)化葉(ye)片(pian)衰(shuai)老進(jin)程，直(zhi)觀反(fan)映(ying)病(bing)毒(du)感染引(yin)發的早(zao)衰(shuai)現(xian)象(xiang)，從而(er)反(fan)映(ying)葉(ye)片(pian)衰(shuai)老。得力(li)於(yu)系統(tong)非侵(qin)入性(xing)檢測(ce)的優點(dian)，可(ke)以實現(xian)實時追蹤植株生理狀(zhuang)態(tai)，避免傳統(tong)取(qu)樣對實驗(yan)的幹擾(rao)和(he)珍貴樣(yang)品(pin)的破壞。而系統(tong)具備的GFP熒光蛋(dan)白(bai)檢測則為可視(shi)化(hua)病(bing)毒(du)分布(bu)、量(liang)化病(bing)毒(du)積累提(ti)供、動(dong)態(tai)監測(ce)感染不同階段病(bing)毒(du)與宿主互作(zuo)的時序性變化提供(gong)了可(ke)靠數據(ju)。FluorCam兼具的兩(liang)項(xiang)技術(shu)共同為擬南(nan)芥抗(kang)病(bing)毒(du)分子生物學(xue)研究提(ti)供了高(gao)效、直(zhi)觀的表型(xing)和(he)分子(zi)水平分(fen)析(xi)工(gong)具。

參考文(wen)獻(xian)：

Zafirov, Delyan, et al. "When a knockout is an Achilles’ heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana."Molecular Plant Pathology, 22.3 (2021): 334-347.